RNAi实现方法及在免疫相关基因功能鉴定中的应用＊

魏衍全,田 宏,吴锦艳,尚佑军,刘湘涛

RNAi实现方法及在免疫相关基因功能鉴定中的应用＊

魏衍全,田 宏,吴锦艳,尚佑军,刘湘涛

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是通过内、外源双链RNA触发的,由19-23bp小分子干扰RNA片段(siRNA)诱导的同源性m RNA的降解,从而使该基因表达沉默(gene silence)的过程。它是广泛存在于动、植物中的序列特异性转录后基因沉默,是生物体在进化过程中,抵御病毒感染及因重复序列和突变引起的基因组不稳定性的保护机制,同时也是一种真核生物体内的基因调控机制。1995年康奈尔大学的 Guo等〔1〕尝试用反义 RNA阻断线虫par-1基因的表达,结果发现反义RNA和正义RNA都阻断了基因的表达。直到1998年Fire等〔2〕在进行线虫基因沉默研究中,分别注射肌肉蛋白的正义、反义和双链 RNA,发现双链 RNA的抑制效果是单链RNA的10到100倍。他们将这种双链RNA抑制基因表达的现象称为RNA干扰(RNAi),并因此获得了2006年诺贝尔生理学或医学奖。此后,已陆续证明在真菌、线虫、果蝇、植物、动物等多种生物中都存在RNAi现象。以下从siRNA如何在细胞内形成来介绍RNAi实现的方法以及RNAi在免疫相关基因功能研究中的最新应用进展。

1 RNAi实现方法

由于siRNA有效地导入哺乳动物细胞并不像导入其他生物细胞那么简单,因此性质稳定、作用持久的siRNA的产生及在哺乳动物细胞内实现功能的方法就成为该项技术得以广泛应用的关键。随着对RNAi生物机制研究的不断深入,为使siRNA最大量地在靶细胞发挥作用,最有效地与靶基因结合,研究者们正在不断地改进各种RNAi实现方法。目前siRNA细胞内形成大体有以下几种途经。

1.1 理化介导法 是指利用各种物理或化学方法将siRNA导入靶细胞。该方法具有安全、易于大量制备和较高的基因包裹能力等优点。目前主要有以下几种方式导入siRNA:(1)磷酸钙共沉淀;(2)电穿孔法;(3)DEAE-葡聚糖或多聚季胺盐(polybrene)法;(4)机械转运法;(5)脂质体法;(6)阳离子聚合物介导法等等。Huang等〔3〕设计并合成了4个针对戊型肝炎病毒(HEV)ORF2基因的siRNA,通过脂质体-2000转染A 549细胞来抑制 HEV的感染。结果显示,脂质体转染的效率很高并且所设计的四个siRNA均能保护细胞免受HEV的感染。

1.2 质粒DNA载体法 虽然直接转染合成的siRNA能特异性抑制哺乳动物细胞内同源基因的表达〔4〕。但是细胞内siRNA很容易被降解,不能实现稳定的RNAi。相比之下,质粒载体就能在细胞内长时间、稳定地生成 siRNA〔5-6〕。通过表达载体在细胞内表达siRNA是研究者为了更有效地利用RNAi而找到的一条新的产生siRNA s的途径。陆续有研究尝试质粒DNA载体介导表达,即用质粒载体表达在细胞内可以转化成siRNA的前体,克服了将化学合成siRNA转染入细胞中的一些缺点。

1.2.1 用 RNA聚合酶Ⅱ(RNA polⅡ)启动子引导的表达体系 在不产生或存在弱的干扰素反应的有机体或细胞类型中,可以采用能够表达 shRNA的质粒DNA载体。这种载体用RNA polⅡ作启动子来启动 shRNA的表达,后被Dicer裂解为siRNA。这种表达体系可以有效地沉默靶基因的表达。

1.2.2 用 RNA聚合酶Ⅲ(RNA polⅢ)启动子引导的表达体系使用RNA polⅢ启动子的质粒载体表达体系可以产生siRNA,而不引起明显的干扰素反应。这种表达体系主要有两类RNA polⅢ启动子,即U 6启动子与 H1启动子,它们都是 RNA polⅢ启动子家族中的成员。RNA polⅢ识别4个以上连续 T碱基的末端终止信号,以便在没有其他因子作用时准确有效地停止转录。

用RNA polⅢ启动子质粒载体来表达siRNA有两种方法。一是用不同的串联启动子来表达siRNA的有义和无义链。二是表达shRNA后被Dicer裂解为siRNA。Zhang等〔7〕构建了带有U 6启动子和嵌合体h TERT/U 6启动子的两种shRNA表达载体,这两种启动子的载体分别靶向 EGFP和h TERT基因。构建的这四种质粒DNA载体分别命名为:shRNA-EGFP-U 6,shRNA-EGFP-h TERT/U6,shRNA-hTERT-U6和shRNA-h TERT-hTERT/U6。结果显示,HELF-EGFP细胞和SMMC-7721-EGFP细胞 GFP的表达均能被 shRNA-EGFP-U 6载体表达的shRNA抑制。无论在体内还是体外,h TERT的表达均能在转染shRNA-h TERT-U 6或shRNA-h TERT-h TERT/U 6的细胞中被抑制。

1.3 病毒载体法 病毒载体凭借高转染率在基因载体领域中占有重要地位。研究用病毒载体须经过改良,去除其病原性的同时保留其高效的基因转染性。常用的病毒载体包括:腺病毒载体,腺相关病毒载体和慢病毒载体。

1.3.1 腺病毒载体 腺病毒载体具有载体包装能力强、细胞毒性反应低等优点,成为近年来RNAi领域研究的重点。目前,利用腺病毒载体将siRNA传递到组织细胞内以干扰相关靶基因的表达已取得了较好的效果。Junn等〔8〕构建了可以从一个转录本编码多个shRNA的腺病毒载体,这些shRNA分别靶向不同的基因位点。结果显示,这种表达多顺反子shRNA的腺病毒载体可以沉默相应的靶基因的表达,其沉默效率和表达单一shRNA的腺病毒载体相同。

1.3.2 腺相关病毒载体 腺相关病毒载体具有可定点整合,携带的外源基因长期持续稳定表达,并可调控;感染率高,但无致病性,且免疫反应轻微等特性已被广泛应用。Chen等〔9〕通过使用双链伴随腺病毒-8假模标本载体(dsAAV 2/8)来转运shRNA到HBV转基因小鼠,结果表明该方法能长期有效地将该模型肝细胞中 HBV蛋白、m RNA、复制型DNA抑制在一个低量的稳定水平。

1.3.3 慢病毒载体 慢病毒载体是一类重组反转录病毒载体,由慢病毒经过改造而成,具有高效整合、高效转录、高效表达和宿主范围广的特点,因此它是真核系统基因转移的有力工具。各种慢病毒载体的结构和作用机制基本相同,主要由三种包含不同结构的质粒构成,分别是转移质粒、辅助质粒、包膜糖蛋白表达质粒。慢病毒载体介导RNAi就是将慢病毒载体高效感染和整合的特性与RNAi特异性抑制同源基因表达的作用相结合。Stew art等〔10〕于2003年首次报道使用慢病毒介导RNAi的技术。他们首先在 HeLa细胞和原代培养的树突状细胞(dendritic cell,DC)中表达外源性绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),然后利用慢病毒载体在这两种细胞中表达针对 GFP的shRNA。实验结果显示:在分裂相细胞(HeLa细胞)和非分裂相细胞(DC)中,慢病毒介导的RNAi都能特异性抑制 GFP的表达。此后的研究证明,慢病毒载体能在原代培养的人巨噬细胞和造血干细胞等哺乳动物各类细胞中实现稳定有效的 RNAi〔11-12〕。Deng 等〔13〕基于慢病毒 RNAi系统来表达针对乙肝病毒(HBV)基因组的特异性的shRNA,然后将该表达shRNA的慢病毒载体与HBV质粒共注射 HBV复制小鼠动物模型。结果显示,在 HBV m RNA和DNA合成水平上,慢病毒系统介导表达的shRNA均可引起显著的抑制效果。笔者目前也在利用RNAi技术开展了病原与宿主细胞间相互作用的研究,其基础是建立在慢病毒表达系统结合U 6 Entry Clone载体上,通过制备抗某种病毒的细胞系,来研究病原与宿主细胞及病原与抑制靶基因的相互关系。

2 RNAi在免疫相关基因功能鉴定中的进展

分子生物学研究的早期,人们对基因的了解都是通过基因突变而获得的。近年来,反向遗传学技术广泛应用于基因功能的研究,使人们对基因功能的研究取得了飞跃式的发展,但该技术在基因重组方面耗时费力。在如今的后基因组时代,RNAi技术以其独特的优势成为分析基因功能的又一种方法,得到了广泛的认同。利用RNAi技术来抑制(或敲低)脊椎动物细胞中任何基因的表达开始了反义遗传学的革命。Lassus等〔14〕研究结果证明,RNAi作为一种实用工具诱导细胞内的基因表达沉默,使得我们以前许多无法运用传统功能基因组学技术研究的机制和模型成为可能,开创了研究基因和蛋白质功能的新天地。

2.1 RNAi技术鉴定基因功能的策略 抑制某个基因表达可以为研究者提供该基因功能的有关信息,这是基因功能研究常用的思路。传统的基因敲除、反义寡核苷酸和核酶技术正是运用了这一思路。虽然这些方法曾为基因研究甚至疾病的基因治疗起到过一定的作用,但最终因其低效、复杂、费时而不能得到推广。自从1998年 Fire等发现RNAi现象以后,研究者们纷纷用dsRNA诱导目的基因的表达抑制,很快RNAi以其特异性和高效性抑制特定基因的表达而成为研究基因功能的强大工具,显示出明显优于基因敲除和反义核酸技术的优势。其优势主要体现在如下几个方面:RNAi比基因敲除简便易行;RNAi容易诱导产生,并且能将目的基因的表达抑制到极低的水平,甚至完全抑制而优于反义核酸技术;RNAi适合进行大规模基因功能的研究。

RNAi技术作为基因功能研究中重要的工具,其原理是:它可针对某个已知基因,设计出可诱导其沉默的dsRNA,通过合适的手段导入细胞或机体,使该基因表达水平下降或完全沉默,从而了解该基因的功能,这是RNAi技术在目前最广泛的应用。借助操作简便的RNAi技术,可在基因组水平批量地沉默众多基因,从而实现大量基因功能的研究鉴定。这些研究已在一些模式生物上成功应用,如果蝇〔15〕、线虫〔16〕、酵母〔17〕等。

2.2 RNAi在免疫相关基因功能鉴定中的应用进展 1999年 Tuschl等〔18〕报道在哺乳动物中也存在RNAi,只是导入的 RNA是siRNA。2001年Bernstein等〔19〕的研究结果表明:只有22bp的siRNA才能特异性地阻断m RNA,同时他们还发现了一个体内分解dsRNA为siRNA的酶-Dicer。以上研究报道为RNA i技术研究免疫相关基因功能开辟了道路,使人们认识到小于30bp(约19bp-25bp)的 siRNA是哺乳动物RNAi赖以发生的重要中间效应分子。siRNA由于片段小,并且可能会通过模仿Dicer酶的酶切产物而并入到RNA i途径中,从而避免引起PKR反应。

为了更有效地利用RNAi途径,研究者找到了一条新的产生siRNA的途径,即构建直接表达长约21-23 bp小片段siRNA的表达载体。Sui等构建的pBS/U 6载体,可以以载体内的DNA序列为模板,直接在转染的细胞中产生特异的高效的siRNA,成功地抑制了内源基因Lamin A/C,Lamin B等的表达。同样,B rummelkamp等〔20〕构建了p SUPER载体,也可有效抑制内源免疫相关基因CDH-1,cyc-Dl,p53的表达。Turner小组〔21〕也作了类似的实验,得到了相应的抑制结果。这些结果表明,RNAi在哺乳动物细胞中是可行的,可以用此技术来鉴定免疫相关基因的功能。

RNAi作为一种有效、快捷和成本相对低廉的基因功能研究手段,它可以通过对免疫相关基因的关键序列进行RNAi来确定该基因的功能。例如,A lvarez A rias DA 等〔22〕利用 RNAi技术培育了缺失网格蛋白接头分子(A P-1)的小鼠,在其胸腺细胞中抑制AP-1的表达,结果阻碍了未成熟的双阳性胸腺细胞进一步发育,导致CD4+T细胞完全消失和CD3+CD8+T细胞严重减少。AP-1缺失在CD4+T细胞和抗原提呈细胞交互作用中的影响表明,AP-1对T细胞的活化和有效免疫突触的形成至关重要。同时该实验解释揭示了AP-1在胸腺细胞发育中发挥功能的可能机制。Tu siRNA实验组将体外构建的siRNA分别导入大鼠成纤维细胞和小鼠细胞,分别抑制了它们的21个不同类型基因,并重新界定了部分必须基因和非必须基因。Boutros M等〔15〕利用RNAi技术建立了一个大规模研究基因功能的方法,该方法能够确定果蝇生长发育的所有基因的功能和作用。这是首先用高通量全基因组扫描的方法对每一个基因的功能进行研究。Zheng L等〔23〕不但应用 RNAi研究了细胞中某些关键基因的作用,还探索了siRNA在基因组水平上的筛选方法。他们从人类基因文库中选择8 000个靶基因,每个基因设计两个靶序列,应用pDual siRNA表达系统产生siRNA表达框架并构建siRNA表达框文库,通过它来高通量筛选NFkB信号途径中已知的及未知的特有免疫相关基因。Huo Q等〔24〕利用p Geneclip U 1发英克隆系统构建了针对胞外信号调节激酶-2(ERK2)的shRNA表达载体,然后转染进 Eca109细胞系来研究人类食道癌Eca109细胞中 ERK2的作用。结果显示,转染进shRNA-ERK2载体的 Eca109细胞与对照组相比,其生长受到显著地抑制。转染后96h的抑制比率为10.45%,ERK2的表达也与对照组相比受到显著地抑制,并且细胞周期停留在了 G1期。

3 现存问题及展望

虽然RNAi技术已在生物学和医学的许多研究领域得到了广泛的应用,为研究生物免疫器官分化和生长发育过程中基因功能提供了有效方法,但仍有许多亟待解决的问题,如:RNAi作用的确切机制;siRNA跨膜扩散的分子基础;寻找定向导入siRNA的手段;哺乳类动物中的干扰素反应;脱靶效应;进行RNAi的时间和靶位点等。所以,今后的研究重点主要集中在RNAi作用的机制,以及如何进一步完善RNAi技术来研究基因的功能。

笔者现已构建了多个抑制口蹄疫病毒复制的U6瞬时载体,在 PK-15细胞中证明均有抑制口蹄疫病毒复制的作用。下一步将结合慢病毒表达系统建立稳定干扰口蹄疫病毒复制的细胞系,在细胞模型水平阐明抑制口蹄疫病毒复制的靶基因及其相互作用机理,并为抗病育种打下基础。可以断言,RNAi技术的应用前景将是不可估量的,特别是在未来功能基因组学和转基因育种中将会起到举足轻重的作用。随着RNAi筛选策略的完善,RNAi在基因功能研究中的应用会日趋成熟。

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1002-2694(2010)11-1067-04

Q789

A

＊“十一五”国家科技支撑计划重大项目(2006BAD06A 03)资助

刘湘涛,Email:hnxiangtao@hotmail.com

中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室 ,国家口蹄疫参考实验室 ,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州 730046

2010-02-15;

2010-06-03