胞内感染菌抗性侯选基因SLC11A1研究进展＊

徐 佳,丁世才,王生奎,柴 俊,刘旭川,孙绍美,史宪伟,张以芳

胞内感染菌抗性侯选基因SLC11A1研究进展＊

徐 佳1,丁世才2,王生奎1,柴 俊3,刘旭川3,孙绍美1,史宪伟1,张以芳1

20世纪初,研究者发现近交系小鼠中,一种遗传因素可以影响宿主对包括鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium),杜氏利什曼原虫 (Leishmania donovani),卡介苗分支杆菌(BCG)等胞内病原体的早期反应。抵抗这些病原体相关的基因分别称为Ity、Lsh、Bcg基因。此后人们发现不同鼠系对结核分支杆菌感染耐受性不同。Bcg基因也对鼠伤寒沙门菌和杜氏利什曼原虫敏感性基因连锁,统称为Ity/L sh/Bcg基因;当以上基因分别独立定位于小鼠1号常染色体定位的同一个位置时,研究者认为是同一个基因参与了宿主抵抗机制,并命名为Bcg基因。1993年,Vidal等通过定位克隆的方法分离出Bcg的候选基因溶质性载体蛋白家族11成员1(Solute carrier family 11 member 1,SLC11A 1)〔1〕。SLC11A 1曾被命名为自然抗性相关巨噬细胞蛋白(natural resistance associated macrophagee protein,NRAM P1)。

SLC11A 1与宿主对一些病毒、细菌、寄生虫等引起的传染病(如:结核病、麻风病)的抗性相关,同时也与一些自身免疫性疾病(如:川崎病、幼年型类风湿性关节炎、风湿性关节炎、肠炎病〔2〕、糖尿病)和癌症的发生存在密切联系。细菌、病毒、寄生虫的感染,长期接触刺激性化学药品或者非消化性的颗粒往往导致机体慢性炎症,而慢性炎症使机体自身免疫病和癌症发病率增高。

结核病是一重大的公共卫生问题,根据世界卫生组织公布,全球结核病每年的新增病例约8百万,每年约有2百万人死于结核病。但结核病感染人群中只有10%发病。以往国内结核病研究主要集中于致病菌本身以及环境因素(糖尿病、酗酒、H IV感染病人和长期应用糖皮质激素)的影响。随着基因组流行病学发展,宿主抗性基因成为新的研究热点,SLC11A 1便是一个主要的自然抗性候选基因。

1 SLC11A1基因

人的 SLC11A 1基因位于2号染色体长臂(2q35)全长14kb。包含15个外显子。由A lu元件和4个内含子分开。与鼠同源性为89%,只有一个拷贝。在5’和3’非编码区(untranslated region,U TRs)、内含子存在明显的种属差异性。

人类SLC11A 1m RNA长2.5kb。SLC11A 1基因3’非编码区包含四个AUUUA重复序列,是一种富含AU的重复序列(AU-rich element,ARE),该重复序列位于2248到2287长约40bp。这些序列与短寿命的致癌基因、细胞因子和生长因子等的m RNA中发现的一些不稳定序列具有同源性。ARE可以通过结合RNA结合蛋白,调控这些m RNA的生成和降解的。小鼠SLC11A 1 3’U TR不含有ARE,其SLC11A 1m RNA具有较长半衰期。

SLC11A 1基因至少有4种多态性可能影响机体对胞内感染菌的抗性,包括启动子的多态性;第4内含子的单个核酸469+14G/C改变(IN T4)多态性;第 543位密码子的非保守碱基 G/A替换(D543N)多态性和3’U TR TGTG缺失多态性。

1.1 SLC11A 1启动子多态性 SLC11A 1 5’末端的Z-DNA微卫星重复序列启动子有四个等位基因。等位基因1和4的频率为0.001,等位基因2的频率为0.2-0.25,等位基因3的频率为0.75-0.8。等位基因1、2、4为弱启动子,等位基因3为强启动子。等位基因2和等位基因3为人类两个主要的SLC11A 1启动子等位基因。这两个等位基因对于SLC11A 1表达水平具有相反的作用。等位基因2,T(GT)5AC(GT)5A C(GT)10GGCA GA(G)6导致SLC11A 1基因低水平地表达,与胞内感染性疾病有关。相反等位基因3,T(GT)5AC(GT)5AC(GT)9GG CAGA(G)6促进SLC11A 1基因高水平地表达,与自身免疫疾病和癌症。有关〔3〕。地域性传染病多发人群,等位基因3通常具有高的分布。而不同人群中存在基因的多样性单模标本结构和连锁不平衡现象,这会改变该人群对疾病的易感性和疾病的感染过程,甚至影响疫苗保护效价,以及预防用药和治疗用药的医疗效果〔4〕。

1.2 IN T4与D543N多态性 对多个多态性位点进行单独基因多态性分析和复等位基因分析,发现IN T4与D543N只有在形成的杂合子时对宿主抗性产生影响,推测各种基因多态性之间对宿主抗性有可能存在协同作用。

1.3 3’U TR TGTG缺失多态性 3’U TR TGTG缺失多态性可能通过影响正常的基因转录过程,导致感染结核后容易发病。

2 SLC11A1蛋白表达

2.1 表达SLC11A 1的细胞系 SLC11A 1在外周血中表达量最高,其次为肺和脾。SLC11A 1在人类网状内皮系统的单核巨噬细胞表达量较高,在髓系细胞〔5〕、神经元细胞〔6〕和包括有垂体前叶、肾上腺髓质和胰岛在内的内分泌组织中呈现限制性的表达特征。人类SLC11A 1基因转化后的红细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和单核巨噬细胞途径中的前体细胞(KG1,U 937,THP)和前髓白血病细胞系 HL-60中不能表达。但这些细胞在粒细胞或者单核巨噬细胞分化途径过程中被区别处理后可以诱导SLC11A 1强烈表达,其影响机制还不清楚。

2.2 SLC11A 1转录的调控 SLC11A 1的调控机制在种间存在差异。不同物种间 SLC11A 1 U TR转录因子结合位点的类型和位置存在差异。人类活性转录因子3(activating transcrip tion factor-3,o r AP-1-like element,A TF3)的结合位点与5’Z-DNA型的微卫星多态性邻近,但在小鼠中没有发现这样的邻近。A TF3对于 TLR4有负调节作用〔7〕。A TF3与JUN蛋白形成异形二聚体可以激活SLC11A 1转录。但A TF3自己形成的同型二聚体与DNA结合时抑制 SLC11A 1转录。A TF3是基础亮氨酸拉链型转录因子A TF/CREB家族的成员。正常条件下A TF3在大多数细胞系里面表达量相对较低,但在生理环境改变情况下,可作为一个快速早期反应基因被强烈诱导表达。这个B-DNA型序列是在大鼠肿瘤抑制基因启动子(p53)和人类转移生长因子B(transfom ing grow th fact B)基因中发现的。虽然它与 SLC11A 1 5’启动子 Z-DNA型微卫星多态性邻近。但是还不清楚这些微卫星是否是SLC11A 1 A TF-3结合位点。Z-DNA的结构对于调节抑制性染色质结构具有重要作用。A TF3结合位点可能是一个在SLC11A 1启动子上的转录活性位点,Z-DNA微卫星重复邻近区域的变异会阻断的不同等位基因间的连锁,可能会影响染色质的形态恢复和转录因子的接近〔8〕。

小鼠巨噬细胞中SLC11A 1的表达可被细菌的脂多糖、IFN-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和炎症刺激上调。

在区分处理后的 HL-60细胞中,SLC11A 1的诱导与SLC11A 1m RNA产生量有关。可以通过调控m RNA的转录过程来调节SLC11A 1的表达量。包含有AREs的m RNA在没有激活的细胞中快速降解,但在特殊的生长状态或者应激状况下,可以改变m RNA的降解速度。

SLC11A 1 ARE通过结合RNA结合蛋白,调控m RNA的生成和降解的。现已经证实很多蛋白可以结合在3’U TR上,尤其是ARE上。在这些蛋白中,多形核核蛋白(DAU F1 o r heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D,hnRNP D)可以加速m RNA的降解,而 HuR稳定 m RNA阻碍其降解。HuR是胚胎致死性异常性家族(embryonic lethal abno rmal vision family)的 m RNA s结合蛋白,36-kDa,包含三个RNA识别位点。这些识别位点对于ARE具有高的亲和力。HuR通过在细胞核内与特异的m RNA结合,与m RNA一同转移到细胞质内,并使m RNA不快速降解。HuR通过作用于ARE对SLC11A 1基因进行转录后调控。但它是否能调节SLC11A 1基因的表达还没有被证实。实验表明HuR在佛波醇豆蔻酸盐(phorbol myristate acetate,PMA)处理的细胞中SLC11A 1结合量大于没有处理过的细胞。PMA诱导的细胞质的 HuR聚合物与 HuR在SLC11A 1 ARE结合量升高和SLC11A 1 m RNA产生量的升高平行相关。这表明 HuR细胞质内的量对于SLC11A 1表达的调控具有重要作用。同时,用RNA干扰剂RNAi下调 HuR的表达造成了SLC11A 1表达量下调,而该下调可以通过在在RNAi处理过的细胞中加入 HuR蛋白而得以修复。HuR在 HL-60细胞中的过度表达可以明显增加SLC11A 1 m RNA的稳定性〔9〕。

2.3 SLC11A 1蛋白 SLC11A 1蛋白是一个高度糖基化和磷酸化的膜整合蛋白,具有2个N端糖基化位点及5个蛋白酶C磷酸化位点。分子量约90-110kDa。具有12个跨膜区(transmembrane domains,TMDs),该跨膜区为包括人类和细菌在内的不同的物种所具有。同时还有1个进化遗留下来的转运点。

在SLC11A 1的MD4上的氨基酸169发生错译突变一个天然的甘氨酸(wild-type;Slc11a1wt)转变成天冬氨酸(mutant;Slc11a1mut)导致小鼠对胞内病原体易感性增加。但是Slc11a1mut小鼠表形难以与SLC11A 1-/-中断突变体区分。然而,在MD4上插入大的带负电的天冬氨酸残基将在巨噬细胞活化过程中发挥的多效性作用。但具体分子机制还不清楚。

Slc11a1wt巨噬细胞和 Slc11a1mut巨噬细胞的吞噬体和溶酶体膜上有低水平的SLC11A 1蛋白。在内涵体膜和Slc11a1mut巨噬细胞控制激活的溶酶体也发现了低水平的 SLC11A 1蛋白。大多SLC11A 1mut存在于内质网,其中含有部分糖基化中间产物。尽管 N端糖基化位点被阻断了,但SLC11A 1wt能正确的转移到内涵体内,糖基化并不影响蛋白质的空间折叠和分类。G169D突变体导致SLC11A 1定点错误折叠,从而被保留在内质网中,表现出功能的丧失。SLC11A 1的变种通常与感染性疾病或者自身免疫性疾病有关〔10〕。

3 SLC11A1作用机理

3.1 SLC11A 1与自由基 SLC11A 1蛋白存在于巨噬细胞的酸性的的吞噬体和溶酶体内。在静息态的巨噬细胞SLC11A 1主要是在吞噬溶酶体中。但当巨噬细胞转为激活态,SLC11A 1将会转移到吞噬体溶酶体膜上,并充当一个顺着金属阳离子浓度梯度转运二价金属离子转运体。同时二价金属离子比如Fe2+、M n2+的浓度水平又反馈调节 SLC11A 1。正常生理状态下,SCL 11A 1在细胞质与酸性吞噬体、溶酶体之间转运二价金属阳离子。酸性晚期吞噬体和溶酶体内发生 Fenton或者 Haber-Wesis反应,产生毒性抗菌的自由基,从而对吞噬体内的微生物产生直接的抗微生物活性〔11〕。巨噬细胞受外界刺激活化产生毒性自由基主要是活性氧和含氮自由基。活性氧包括有过氧化物、单线态氧、过氧化氢、羟自由基〔12〕。含氮自由基主要是在一氧化氮合成酶作用下产生一氧化氮。细菌自身也会合成自身的以Fe2+或其他金属离子为辅助因子的活性氧清除系统,如SOD、CA T等来清除自由基。SLC11A 1顺浓度梯度外排金属离子,让细菌自身合成的自由基清除系统失活,从而由自由基清除机体病原微生物。是一种机体防御机制。

但同时,自由基长期积累往往导致组织损伤,诱发一些包括肿瘤和癌症在内的渐进性发展疾病。来源于活化态巨噬细胞的过氧化氢可以一些过度元素结合,通过SLC11A 1转运进溶酶体、晚期吞噬体内的DNA或者RNA或者扩散到原子核,引起变性损伤,甚至导致肿瘤变异。同时SLC11A 1是顺p H梯度的由高到低转运金属离子。

检测类风湿病人的滑膜和动脉粥样硬化病人的泡沫细胞铁离子明显增高。这很有可能是与SLC11A 1相关。因为由死亡细胞释放的核酸和蛋白质微粒作为自身抗原,能被具 T细胞受体(TLR)3,7,8,9激活了的B淋巴细胞识别,进而B细胞成为具有抗体产生能力的浆细胞〔13〕,SLC11A 1可能也与系统性红斑狼疮的发病机制有关。感染牛结核的小鼠吞噬体中SLC11A 1的含量明显高于没有被感染的小鼠。

3.2 SLC11A 1与免疫应答反应 胞内病原菌如沙门氏菌减弱菌株可以广泛用作工程菌传递和表达疫苗抗原。而SLC11A 1可以通过控制细菌的复制、重组抗原剂量、M HCⅡ表达和佐剂的活性来影响重组细菌疫苗反应。或者通过控制晚期吞噬体蛋白酶活性来影响抗原加工,SLC11A 1在巨噬细胞中调控铁离子的动态平衡从而多效性地影响巨噬细胞系统,包括增强干扰素(IL-1β)、促进趋化因子 KC(chemokine KC)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的生成〔14〕和促进一氧化氮的释放(NO)。通过造成M HCⅡ表达数量上的差异,影响抗原信息传递给 T细胞的过程。通过序列测定和定点克隆,发现含有SLC11A 1的野生型等位基因老鼠活体中倾向于Th1的免疫反应。Th1细胞有益于抵抗巨噬细胞胞内病原体的感染,但是有可能造成Ⅰ型糖尿病。诱发Th2免疫反应的小鼠则含有突变体等位基因。

SLC11A 1促进炎性复合物的聚集和巨噬细胞分泌前白介素1β(IL-1β)和白介素18(IL-18)。并可以在细胞质解旋酶维甲酸诱导蛋白 Ⅰ(retinoic acidinducible protein I,RIG-I)和黑素瘤化相关蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5,MDA 5)作用下调控抗病毒反应。SLC11A 1通过调节细胞内核苷酸寡聚化结构域(nucleotide–oligomerization Domains,NODs)功能影响细胞凋亡过程。NODs是炎性复合物的组成部分。NODs蛋白功能的失去或者获得会导致机体对几种免疫反应失调丧失调控能力。细胞内基因在含铁量降低时,阻碍细胞生长。所以SLC11A 1转录的激活导致细胞凋亡,相反,转录抑制时细胞继续生存。SLC11A 1通过调节晚期吞噬体内抗原加工提呈过程和影响相关蛋白酶激活来影响病毒载体传递系统的免疫反应。例如疱疹病毒的Cp G载体传递系统、腺病毒双链RNA、逆转录病毒载体、单链 RNA、腺病毒相关病毒载体单链DNA和杆状病毒载体〔15-17〕。

SLC11A 1导致细胞因子在感染部位的聚集,并影响感染后的结果。例如巨噬细胞活化可能表现为只单独存在IL-6、IL-6和 TGF-β两者都有或者只有TGF-β三种状态,表现何种状态决定着何种型的Th细胞被激活。在 IL-6的单独诱导下,前列腺素生成量提高。前列腺素在氧自由基的生成过程中有重要作用〔18〕。IL-6与 TGF-β协同对于幼稚 T细胞分化成为能产生IL-17前炎症 Th细胞。在试验动物模型中IL-17与慢性炎症和自身免疫病的发生有关〔19〕。TGF-β可单独在神经末梢周围诱生抗炎症的双叉蛋白3(forkhead box protein.FOXP3)表达调控 T细胞〔20〕。结核皮肤测试阳性病例与阴性病例的FOXP3基因表达存在明显差异。

另一类调节性T细胞在长期高水平的IL-10影响下缺乏FOXP3的生成。这类抑制性 T细胞能抑制特异性抗原反应和下调病理免疫反应。SLC11A 1启动子等位基因2多态性,影响 IL-10的生成并造成不同年龄、性别、种族的结核病人或者结核痊愈病人产生高水平的IL-10。激活的巨噬细胞和主要SLC11A 1等位基因在SLC11A 1功能中发挥不同的作用。但是SLC11A 1怎样通过调节这些细胞因子的生成而影响感染后的结果的机制还不清楚〔21〕。

4 展 望

根据SLC11A 1具体的作用机制可通过生物技术研发合成人类新型的具有广谱抗菌作用抗生素药品和保健药物。在抗病育种方面也可培育广谱抗病性的金属离子高效吸收转运的动、植物新品种。开展基因组流行病学研究,有助于肺结核等传染病高危人群的预测,从而为优选干预措施提供科学依据。

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1002-2694(2010)11-1071-04

R37

A

＊云南省高层次科技人才培引工程(2009 CI 125)和云南省自然科学基金(2009 CD 058)项目联合资助

张以芳,Email,zyfkm@yahoo.com.cn

1.云南农业大学动物科学技术学院,昆明 650201;2.云南省曲靖市妇幼医院检验科,曲靖 655000;3.云南农业大学,昆明 650201

2010-05-26;

2010-08-31