莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆与序列分析

陆叶 ，李良俊 ，梁国华 ，陈学好

（1.扬州大学水生蔬菜研究室，扬州，225009；2.扬州大学教育部植物功能基因组学重点实验室）

莲藕（Nelumbo nuciferaGaertn）是睡莲科多年生水生草本植物，在我国南方普遍种植。莲藕产品鲜藕、藕粉和莲籽是公认的滋补食品，含丰富的淀粉、蛋白质、多种维生素和矿质营养，是优良的特色蔬菜和副食佳品，具有很好的营养保健功能，深受消费者欢迎[1]。随着我国加入WTO，莲藕加工产品盐渍藕、水煮藕及藕粉等远销日本、韩国及欧、美等国家和地区，已成为我国重要的出口创汇蔬菜之一。但不同加工产品对莲藕品质的要求不一致，影响莲藕加工品质的是以淀粉为主的碳水化合物，其中直链淀粉含量对莲藕加工、食用品质有重要影响，而直链淀粉的合成由颗粒结合淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase,简称GBSS）基因调控。

因此，本试验以莲藕幼嫩叶片为材料提取总RNA，根据GenBank中已发表的其他植物GBSS cDNA序列的同源区域设计5'和3'端特异性RACE引物，利用RT-PCR和RACE技术扩增得到莲藕GBSS基因的全长cDNA序列，并对其序列进行分析，以期能全面了解莲藕中该基因催化和调控直链淀粉的合成功能，为脆质类型莲藕新品种的分子辅助选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验品种为生产上广泛应用的“美人红”。种藕于2009年4月定植于扬州大学水生蔬菜试验基地，栽培管理同大田。晴朗中午选取生长健壮植株的幼嫩叶片，液氮速冻后置于-80℃保存备用。

E.coli DH5α 感受态细胞、LA Taq 酶、pMD18-T载体、DNA凝胶回收试剂盒、DL2000 DNA Marker、3'-Full RACE Kit、5'-Full RACE Kit、限制性内切酶 EcoRⅠ和HindⅢ均购自TaKaRa公司。

引物和cDNA序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成及测定。

1.2 试验方法

①幼叶总RNA的提取 采用改良CTAB法提取幼叶总RNA[2]。

②莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆 a.3'端序列的克隆。所用试剂均来自TaKaRa的3′-Full RACE试剂盒。

b.引物设计。根据GenBank中已发表的马铃薯和大豆GBSS基因的cDNA序列，在保守区段设计引物（图1）。

c.5'端序列的克隆。所用试剂均是来自TaKaRa的5′-Full RACE试剂盒。

d.引物设计。根据得到的莲藕GBSS基因cDNA 3'端的序列，用Primer 5软件设计5'端RACE引物（图2）。

2 结果与分析

2.1 幼叶总RNA的提取、完整性检验及RACE反应

由图3可以看出，CTAB法提取的莲藕幼叶总RNA效果较好，其电泳条带锐利，表明在提取过程中无RNA降解现象，可用于下面实验。

由图4可以看出，3'端RACE-PCR后出现的条带大小在1 000 bp左右，5'端RACE-PCR后出现约1 200 bp的条带，与预期条带基本一致。两个目的条带都非常清晰明亮。

图1 用于引物设计的GBSS cDNA序列同源性分析

图2 用于5'端RACE引物设计的莲藕GBSS基因的cDNA片段

图3 莲藕幼叶的总RNA的凝胶电泳图

图4 通过RACE获得的莲藕Wx基因cDNA片段

图5 BamHⅠ和HindⅢ双酶切验证重组质粒

图6 莲藕GBSS基因cDNA全长序列

图7 不同植物GBSS基因氨基酸序列同源性比较

图8 不同植物GBSS基因氨基酸序列的聚类分析

2.2 酶切验证

含有莲藕 Wx基因cDNA片段的重组质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后得到的条带大小与预期条带大小接近（图5）。说明目的片段已成功克隆进载体pMD 18-T，可进行基因测序。

2.3 测序结果分析

①序列分析 拼接RACE技术扩增得到的莲藕GBSS基因cDNA的3'和5'端序列，获得一条含poly（A）尾，长度为 2 265 bp的全长 cDNA序列（图6），GenBank登录号为EU938541。该 cDNA序列包含108 bp的5'非编码区和309 bp的3'非编码区，其长为1 848 bp的开放阅读框 (ORF)共编码615个氨基酸。

用DNAman软件对该核苷酸序列与GenBank中其他植物的该基因序列进行比对，发现与水稻（EU735072）、大豆（EF153101）、马铃薯（EU403426）cDNA 序列的同源性分别达 50.64%、64.23%、59.62%。

②氨基酸序列（GBSS）同源性分析 GBSS基因编码的氨基酸序列在NCBI网站上进行Blastp分析发现，该序列与金鱼草的同源性最高，达到77%，与马铃薯、甘薯的同源性达到75%，与豆科植物的同源性在70%～75%，与禾本科植物的同源性在65%～70%（图7）。

用Clustalx软件将推导的氨基酸序列与GenBank中的其他植物的GBSS基因的氨基酸序列进行聚类分析，莲藕颗粒结合淀粉合成酶序列（GBSS）与金鱼草、马铃薯、甘薯的颗粒结合淀粉合成酶最为相似，聚在一起。禾本科植物如水稻、小麦、玉米等单子叶植物单独聚成一类。豆科植物大豆、豌豆单独成一类（图8）。

3 讨论

颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）在直链淀粉合成上起着非常重要的作用。直链淀粉含量（Amylose content，AC）被认为是决定稻米、小麦食用品质的最主要因子，而莲藕加工、食用品质与淀粉特性及表观直链淀粉含量有关。表观直链淀粉含量高，莲藕品质相对较脆嫩爽口；表观直链淀粉含量低，莲藕品质相对较糯、口感粉酥[3]。同时有研究表明，淀粉含量多少以及直链淀粉和支链淀粉含量比例的关系与Wx基因有密切的关系[4]。当植物体内缺乏GBSS蛋白时,合成淀粉中缺乏直链淀粉；利用反义RNA技术特异地抑制Wx基因的表达，降低GBSS酶的活性，则导致直链淀粉含量下降[5，6]，表明GBSS主要调控直链淀粉的合成。研究莲藕GBSS基因的结构和功能，有利于我们更进一步了解莲藕淀粉合成机理，为调控该基因、改良淀粉品质提供理论基础。

过去的20 a里，一些单子叶谷物如水稻、玉米、小麦等和一些双子叶植物如马铃薯、大豆等编码GBSS的基因cDNA全长序列已经得到。本试验根据已发表的不同作物GBSS基因cDNA同源序列设计特异引物，利用RT-PCR和RACE技术得到了莲藕该基因cDAN全长序列，通过软件分析得知其开放阅读框（ORF）为 109～1 956 bp，编码 615 个氨基酸。将氨基酸序列在NCBI网站上进行BLAST比对，与上述作物的同源性为65%～80%，证明试验得到的序列就是莲藕GBSS基因的cDNA序列。

不同植物GBSS基因氨基酸序列的聚类分析与目前所接受的植物学分类大体一致。禾本科植物如水稻、小麦、玉米等单子叶植物单独聚成一类；豆科植物大豆、豌豆单独成一类；莲藕与金鱼草、马铃薯、甘薯聚在一起，说明这四种植物颗粒结合淀粉合成酶结构较为相似。聚类结果可初步反映植物在长期进化过程中的一些变化。

[1]李良俊，林惠鸣，曹碚生.江苏省莲藕无公害生产中存在的几个问题[J].中国农学通报，2003，19（4）：156-158.

[2]徐昌杰，陈昆松，张波，等.柑橘组织RNA提取方法研究[J].果树学报，2004，21（2）：136-140.

[3]李良俊，张晓冬，沈新平，等.莲藕淀粉RVA谱特征和淀粉粒形态的研究[J].园艺学报，2006，33（3）：534-538.

[4]耿俊丽，胡芳名，张党权.蜡质基因研究进展[J].中南林学院学报，2005，25（4）：101-104.

[5]Tsai C Y.The function of the waxy locus in starch synthase in maize endosperm[J].Biochem Genet，1974,11:83-96.

[6]Sano Y.Differential regulation of waxy gene expression in rice endosperm [J].Theoretical and Applied Genetics,1984,68(5):467-473.