汞或镉及其联合应用对去卵巢大鼠的雌激素样作用

王思华，陈小玉

(1.河南省职业病防治研究院劳动卫生科，河南郑州 450052;2.郑州大学公共卫生学院毒理学教研室，河南郑州 450001)

环境雌激素是较为重要的一类内分泌干扰物，环境雌激素样物质既具有其自身的化学特性，还具有雌激素样作用，无论这些物质雌激素样作用的强弱，都能增加额外的雌激素负荷［1］。当亲代暴露于环境雌激素样物质，不仅对机体自身内分泌、神经、生殖和免疫等多系统造成损害，而且能够对子代造成不可逆的损害［2-6］，最近几年引起广泛关注。汞和镉广泛存在于生产和生活环境中，它们对人类和动物的损害作用是否也是通过内分泌干扰作用，而且两者联合是否有雌激素样作用，目前还未有确切证据。本研究采用去卵巢大鼠子宫增重实验和大鼠子宫内膜增殖实验探讨HgCl2和CdCl2及二者联合应用的雌激素样作用，为进一步研究其生殖发育毒性作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

HgCl2，分析纯，北京化工厂。CdCl2，分析纯，中国亭生化学试剂厂。雌二醇(estradiol，E2)，Sigma公司产品。核仁组成区相关嗜银蛋白 (argyrophilic nucleolar organizer region-associated proteins，Ag-NORs)银染工作液的配制:用体积分数为10%的甲酸配制体积分数为2%的明胶溶液，再将明胶溶液与体积分数为50%的硝酸银按体积比1∶2混合即成。

868045型普通光学显微镜(日本Olympus公司)，切片机(湖北徕克医疗仪器有限公司)、电子天平(德国Sartorius公司)。

1.2 动物和去卵巢大鼠模型的建立

成年雌性SD大鼠66只，体重210～230 g，由河南省实验动物中心提供，动物许可证号:医动字第410117号。饲养环境温度为 18～22℃，湿度60% ～70%，昼夜周期为12 h/12 h，普通饲料饲养，自由饮水进食。

将性成熟雌性SD大鼠实验室适应3 d后，称重，剪毛，ip给予2%戊巴比妥钠 2.0 ml·kg-1麻醉成功后，腹卧位固定，用碘酊消毒手术区皮肤，沿背中线切开皮肤，切口上端达最后一肋骨处，下端止骶骨。脊柱两侧切开肌层，到达腹腔，取出子宫和卵巢，分离脂肪组织，暴露输卵管，沿输卵管处切除卵巢，复位子宫，缝合切口，ip给予庆大霉素1 ml，防止动物手术后感染。

去卵巢SD大鼠于手术后第3天，每只大鼠行阴道涂片，连续5 d，即用棉签蘸少量生理盐水，插入阴道内轻轻旋转两圈，取出，在玻璃片上涂抹数次，于低倍镜下观察白细胞和角化上皮细胞出现情况，判断卵巢摘除是否完全。连续涂片5 d，镜下均见大量白细胞和少量黏液，未见典型的角化上皮细胞出现判定为卵巢摘除完全;若有大量的典型角化上皮细胞出现，而只有少量的白细胞出现判定为卵巢摘除不完全。

1.3 动物分组及给药

［7］将完全摘除卵巢的大鼠，于术后第8天随机分为11组，每组6只，分别为去卵巢模型对照组(给予生理盐水);E20.08 mg·kg-1(阳性对照组)，以花生油为溶剂;HgCl20.04，0.20 和1.00 mg·kg-1组;CdCl20.08，0.40 和2.00 mg·kg-1组，HgCl2+CdCl2(0.04+0.08)，(0.04+0.40)和(0.04+2.00)mg·kg-1，给药容积为2.0 ml·kg-1，每天 ip 给予1 次，连续3 d。

1.4 取材和制片

最后一次给药后24 h，称重，颈椎脱臼处死大鼠，处死前2 h每只大鼠ip给予秋水仙碱4 mg·kg-1，使细胞分裂停滞于有丝分裂中期。迅速取出子宫，称质量后，于子宫中段垂直于子宫角长轴朝子宫体方向切取约1 cm子宫组织，经Bouin固定液固定，在24 h内，用体积分数为70%乙醇洗涤直至苦味酸的黄色消失。常规石蜡包埋，一半切片进行常规HE染色;另一半进行硝酸银染色。

1.5 子宫脏器系数测定

准确称量子宫质量(g)和体重(g)，子宫脏器系数=子宫质量(g)/体重(g)×100。

1.6 有丝分裂指数测定

参照文献［8］在油镜下，常规 HE染色的每个切片随机选取10个视野，每个视野计数40个子宫内膜腺体细胞，记录处于有丝分裂的细胞数，按下式计算有丝分裂指数(mitotic index，MI)(%)=有丝分裂细胞数/观察细胞数×100%。每只大鼠观察2张切片，结果取平均值。

1.7 Ag-NORs颗粒数观察

Ag-NORs颗粒为黑色颗粒，位于核仁中与细胞核内(细胞核背景呈淡黄色)。在油镜下，每个切片随机选取10个视野，每个视野计数40个染色均匀、背景清晰的细胞，计数Ag-NORs颗粒数，并计算每个细胞Ag-NORs颗粒数。每只大鼠观察2张切片，结果取平均值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 HgCl2或Cd Cl2及二者联合对去卵巢SD大鼠子宫的增重作用

表1结果表明，与去卵巢模型对照组比较，HgCl21.00 mg·kg-1组、CdCl22.00 mg·kg-1组及HgCl2+CdCl2(0.04+0.08)和(0.04+2.00)mg·kg-1组大鼠的子宫脏器系数明显升高(P＜0.05);与相应剂量 CdCl2组比较，HgCl2+CdCl2(0.04+0.08)mg·kg-1组的子宫脏器系数明显升高(P＜0.05)。

表1 氯化汞(HgCl2)或氯化镉(Cd Cl2)及其二者联合对去卵巢大鼠子宫子宫脏器系数的影响Tab.1 Effect of mercury chloride(HgCl2)，chromium chloride(Cd Cl2)and their combination on the uterine organ coefficient in ovariectomized rats

2.2 HgCl2或CdCl2及二者联合对去卵巢SD大鼠子宫内膜细胞有丝分裂指数的影响

表2结果显示，与去卵巢模型对照组相比，除了 CdCl20.08 mg·kg-1组外，其余各组大鼠的 MI有明显差异(P＜0.05);与相应剂量 CdCl2组比较，HgCl2+CdCl2(0.04+0.08)和(0.04+0.40)mg·kg-1的 MI值明显增高(P ＜0.05)。

表2 HgCl2或Cd Cl2及二者联合对去卵巢大鼠子宫内膜细胞有丝分裂指数的影响Tab.2 Effect of HgCl2，CdCl2 and their combination on the mitotic index of endometrial cells in ovariectomized rats

2.3 HgCl2或CdCl2及二者联合对去卵巢SD大鼠子宫内膜细胞Ag-NORs颗粒数的影响

表3结果显示，与去卵巢模型对照组相比，HgCl21.00 mg·kg-1组、CdCl22.00 mg·kg-1组及HgCl2+CdCl2(0.04+0.08)和(0.04+2.00)mg·kg-1组的去卵巢大鼠子宫内膜Ag-NORs颗粒数有明显增高(P＜0.05);与相应剂量的CdCl2组比较，仅HgCl2+CdCl2(0.04+0.08)mg·kg-1组的差异具有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

子宫增重实验是最早建立的检测雌激素活性的经典方法，目前仍被广泛应用。大鼠去卵巢后，当给予其雌激素样物质后，能诱导靶细胞增殖与分化，表现为子宫重量增加，测定子宫重量或子宫脏器系数，就能够反映雌激素活性和强度［9-10］。在去卵巢SD雌性大鼠子宫增重实验中，阳性对照雌二醇组子宫脏器系数明显高于去卵巢模型对照组。HgCl2组和CdCl2组子宫脏器系数呈剂量-效应关系，但经单因素方差分析，仅高剂量组与去卵巢模型对照组相比，有显著差异(P ＜ 0.05)，与申立军等［7］和 Höfer等［11］研究结果一致，进一步证明了HgCl2和CdCl2在高剂量时具有雌激素活性。

表3 HgCl2或CdCl2及二者联合对去卵巢大鼠子宫内膜细胞Ag-NORs颗粒数的影响Tab.3 Effect of HgCl2 and CdCl2 and combination on the Ag-NORs number of endometrial cells in ovariectomized rats

Soto等［12］亦认为子宫增重实验所采用的子宫重量变化等指标的敏感性不够。为此，本研究选用去卵巢大鼠子宫内膜增殖实验，根据MI的变化来判断细胞的增殖速率、细胞周期和有丝分裂时间［8］。本研究结果显示，与去卵巢模型对照组相比，除HgCl20.04 mg·kg-1组外，HgCl2和 CdCl2各剂量组 MI均明显增加，且随着染毒剂量的增加而递增(P＜0.05)。此实验结果佐证了HgCl2和CdCl2具有雌激素活性。

核仁组成区(nuclear organizer region，NOR)具有嗜银性，因此可以用胶体银染色技术加以检测。Ag-NORs是被硝酸银染色的NOR区，由某些染色体上聚集的蛋白质组成［13］(即具有转录活性的r-DNA区域周围的酸性非组蛋白(B23蛋白和C23蛋白))，主要生物学功能为参与调控核糖体前RNA的转录、加工和装配或调节RNA聚合酶Ⅰ亚单位，起维持RNA链伸展的作用，可以反映核仁结构与功能的变化，还可以作为细胞r-DNA转录活性的标志物［14］，是反映细胞增殖的良好指标。本研究通过Ag-NORs这个敏感指标，观察HgCl2与CdCl2的雌激素活性。结果表明，HgCl2和 CdCl2各剂量组Ag-NORs呈剂量-效应关系;与去卵巢模型对照组相比，高剂量HgCl2组和CdCl2组Ag-NORs有明显差异(P＜0.05)，亦佐证了HgCl2和CdCl2在高剂量时具有雌激素活性。

去卵巢SD大鼠子宫增重实验和Ag-NORs颗粒数实验中，HgCl20.04 和 0.20 mg·kg-1未表现出雌激素活性，CdCl20.08 和 0.40 mg·kg-1亦未表现出雌激素活性。

HgCl20.04 mg·kg-1和 CdCl20.08 mg·kg-1均不能提高去卵巢SD雌性大鼠子宫脏器系数，但二者联合作用后，能够提高去卵巢SD雌性大鼠子宫脏器系数，与去卵巢模型对照组和CdCl2相应剂量组相比差异显著(P＜0.05)，说明二者联合具有雌激素活性，提示二者能够产生联合效应。未显示雌激素活性剂量的HgCl2与各剂量CdCl2混合后的子宫脏器系数均比相应剂量CdCl2组的子宫脏器系数增加，说明低剂量HgCl2能够提高CdCl2各剂量组雌激素活性，尤其(HgCl2+CdCl2)低剂量组与相应剂量CdCl2组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明未显示雌激素活性剂量的HgCl2可使不显示激素活性剂量CdCl2显示雌激素活性。二者之间能够产生联合作用，可能与HgCl2和CdCl2同为二价重金属，具有相似的作用机制和靶位点有关。

去卵巢子宫内膜细胞增殖实验亦表明，HgCl20.04 mg·kg-1能够明显提高 CdCl2各剂量组 MI值(P＜0.05)。与相应剂量的CdCl2组比较，中、低剂量组的有明显差异(P＜0.05)，说明HgCl2能够增强CdCl2的雌激素活性，使原本未显示雌激素活性剂量的CdCl2表现有雌激素活性，而高剂量CdCl2雌激素活性增加不明显，但仍具有明显的雌激素活性。

HgCl20.04 mg·kg-1能够提高 CdCl2各剂量组Ag-NORs颗粒数，与相应的CdCl2组比较，仅低剂量组的差异具有统计学意义(P＜0.05);但与去卵巢模型对照组相比，高、低剂量组有明显差异(P＜0.05)。同样说明了低剂量HgCl2能够增强CdCl2的雌激素活性，使原本未显示雌激素活性剂量的CdCl2表现有雌激素活性剂量。

本研究中，子宫增重实验、子宫内膜细胞有丝分裂指数和子宫内膜细胞Ag-NORs颗粒数三项指标结果均能证明未显示雌激素活性剂量的HgCl2可使不显示激素活性剂量CdCl2显示雌激素活性，说明了二者有联合作用。但上述三项结果均为HgCl2+CdCl2(0.04+0.40)mg·kg-1最低，可能由于样本量小，需要进一步的实验研究。

本研究提示环境雌激素之间能够产生联合作用，特别是低剂量时联合作用更加明显，即使是以未显示雌激素活性的剂量混合，仍然能够显示出雌激素活性。事实上，在环境中HgCl2和CdCl2多以较低浓度混合存在，如单独研究其中一种物质在较低剂量时的雌激素样作用，往往会发现它们对生物体几乎不产生任何损害作用。人类在生活、生产中，往往同时或相继接触二者，当以无雌激素样作用剂量或低雌激素样作用剂量混合进入机体后，一部分经代谢排出，但大部分能够在体内蓄积，产生联合作用。另外，HgCl2和CdCl2具有不易降解、残存期长等特点，因而应广泛关注其危害。

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