艾叶油对小鼠胚胎骨骼发育的影响

兰美兵，李啸红，江惠彩，张 宏，余永莉

(遵义医学院珠海校区人体解剖学与组织胚胎学教研室，广东珠海 519041)

艾叶为菊科植物艾(Artemisia argyi Levl.et Vant.)的干燥叶，具有温经止血、散寒止痛、外用祛湿止痒等功效，但有小毒［1］。艾叶油是从艾叶中提取出来的挥发油，既是艾叶的功效成分也是其毒性成分［2］，为临床常用的中药制剂。目前已报道有艾叶油急性和亚急性毒性研究［3－5］，但其是否具有遗传毒性与胚胎毒性未见报道。为指导与开拓艾叶油在临床上安全、有效、合理的应用，尤其是为育龄期人群的安全用药提供实验参考依据，本研究通过观察胎鼠的身长、尾长、前肢芽Neubert评分及主要骨骼发育骨化点出现的数量探讨艾叶油对胚胎骨骼发育的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明种小鼠，普通级，由遵义医学院珠海校区医学动物中心提供，其雌性体重25～30 g，雄性体重30～35 g。饲养条件:室温为26～30℃，排风扇通风，相对湿度为70% ～80%，自由饮食，进水。

1.2 药品、试剂与仪器

艾叶油(珠海德信行，水蒸气蒸馏提取，纯度98%，产地:甘肃，批号:20081127。经气相色谱-质谱法分析，主要组分为桉油素 20.45%、蒿醇12.12%、樟脑 6.99%、蒿酮 5.85%、龙脑4.274%、伞花烃3.07%和侧柏酮2.58%等)，环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号:20070310)，花生油(金龙鱼食用油有限公司，市售)，阿利新蓝(上海蓝季科技发展有限公司，批号:090130)，茜素红(天津石英钟厂，批号:971213)。其余试剂均为国产分析纯。阿利新蓝染液、茜素红染液、胚胎骨骼透明液均参照文献［6］配制。

游标卡尺，上海恒量量具公司;电子恒温水浴锅，汕头市医学设备公司;SZ-61体视镜，日本Olympus公司。

1.3 动物分组

将健康小鼠按雌、雄2∶1的比例于每晚18:00时合笼，次日晨6:00～8:00时检查阴栓，查见阴栓者定为孕0 d。选25只孕0 d小鼠随机分为5组，每组5只。正常对照组，每只给予花生油0.4 ml;艾叶油组，根据本课题组测定的ig给予艾叶油LD50为4.11 ml·kg－1，设计艾叶油剂量分别为 1/2，1/4 和1/8LD50的量，用花生油配制艾叶油，分别为2，1和0.5 ml·kg－1。孕鼠于孕第 12 ～16 天 ig 给药;环磷酰胺组，只于孕第13天ip环磷酰胺12.5 mg·kg－1。每天观察孕鼠的摄食、饮水、生长等一般状况。

1.4 胎仔身长和尾长的测量

各组孕鼠于孕第16天最后一次用药2h后，颈椎脱臼法处死、解剖腹部、分离子宫取出胎鼠。游标卡尺测量胎仔身长和尾长。

1.5 Neubert评分法［7］评价胎鼠前肢芽软骨及全身主要骨骼的骨化

每窝随机选取1/2胎鼠浸泡于80℃的水浴锅中10 s后，用镊和眼科剪仔细剔除皮肤与内脏，浸入阿利新蓝染液中染色48 h，随时在体视镜下观察标本中软骨呈现蓝色(较染色液颜色略深)时，再用自来水轻轻冲洗2～3次，再浸入茜素红染液中36～48 h，每隔12 h左右换液1次，直到胎鼠骨骼呈清晰的紫红色为止，用自来水轻轻冲洗2～3次。将双染后的胎鼠放入新配制的透明液溶液中36～48 h。体视镜下观察胚胎软骨呈蓝色，骨骼骨化部分呈现紫红色。用Neubert评分法评价胎鼠前肢芽软骨及全身主要骨骼的骨化等发育情况。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 艾叶油对胎鼠身长和尾长的影响

表1结果显示，与正常对照组比较，艾叶油2，1和0.5 ml·kg－1组身长和尾长无显著性差异;阳性对照环磷酰胺 12.5 mg·kg－1组胎鼠发育迟缓，其身长和尾长显著缩短(P＜0.05)。与阳性对照环磷酰胺组比较，艾叶油各组身长和尾长发育良好，明显长于环磷酰胺组(P＜0.05)。说明环磷酰对胎鼠身长和尾长的发育有抑制作用，而艾叶油对胎鼠身长和尾长的发育无影响。

表1 艾叶油对胎鼠身长和尾长的影响Tab.1 Effect of volatile oil from A.argyi on body and cauda length of the embryonic mice

2.2 艾叶油对胎鼠前肢芽软骨发育的影响

表2结果显示，与正常对照组比较，艾叶油2，1和 0.5 ml·kg－1组小鼠胚胎前肢芽 Neubert总评分无显著性差异。阳性对照环磷酰胺12.5 mg·kg－1组前肢芽各软骨发育分化较差，Neubert评分较低。与阳性对照环磷酰胺组比较，艾叶油2，1和0.5 ml·kg－1组小鼠胚胎前肢芽发育分化良好，其Neubert总评分明显高于环磷酰胺组(P＜0.05)。说明艾叶油在本实验条件下对胎鼠肢芽的发育分化无毒性作用。

2.3 艾叶油对胎鼠椎骨与四肢远端骨骼骨化点形成的影响

经双染后软骨成蓝色，骨化部分成紫红色。孕第16天胎鼠的尾椎、腕骨和跖趾骨在此阶段仍为软骨，因此骨化点均为0。表3结果显示，与正常对照组比较，艾叶油各组的主要骨骼发育骨化点出现的数量无显著性差异;但各组与环磷酰胺12.5 mg·kg－1组相比较，具有显著性差异(P＜0.05)。说明艾叶油在本实验条件下对胎鼠的骨骼骨化无影响。

表2 艾叶油对胎鼠前肢芽软骨发育的影响Tab.2 Effect of volatile oil from A.argyi on differentiation of the embryonic mice forelimb buds

表3 艾叶油对胎鼠椎骨及四肢远端骨骼发育骨化点数的影响Tab.3 Effect of volatile oil from A.argyi on skeletal developmental ossification points of the embryonic mice vertebrae and limbs distal end

3 讨论

随着近年来中药的不良反应和毒性报道的增加，中药的毒副作用得到了高度重视。胚胎毒性作为中药不良反应的重要方面之一，正日益受到重视。应用各种胚胎发育毒性实验技术研究中药的胚胎毒性，已成为当前中药毒理学研究的一个重要领域［8］。现代药理学研究证明，艾叶油具有镇咳平喘［9］、抑菌［10］、抗肿瘤［11］以及关节软骨的保护［12］等作用，具有较高的医药价值，已开发出艾叶油软胶囊、艾叶油滴丸和复方艾叶油软膏等应用于临床。艾叶油是多成分的混合物，不同的产地，成分也有所差异［13］。本实验所用艾叶油的主要功效成分为桉油素、樟脑、龙脑和伞花烃等，但同时也含有毒性成分，如侧柏酮。因此，研究各地的艾叶及其制剂的生殖毒性具有重要的意义。

胎鼠器官发育的关键期为7.5～16 d。因此，在此阶段内用药可以了解对胎鼠器官的影响情况。骨骼畸形是评价外界化合物对机体影响的主要内容之一。常常通过骨骼染色来观察骨骼的发育情况。Menegola等［14］认为，通过阿利新蓝和茜素红双染可以较准确地判断外界物对骨骼发育的影响。将肢芽发育分化用于评价药物对骨的发育毒性是可靠和敏感的［15］。本实验应用艾叶油2，1 和0.5 ml·kg－1在小鼠胚胎器官发育敏感期给药，观察艾叶油对小鼠胚胎骨骼发育毒性和致畸作用。实验结果显示艾叶油 2，1 和 0.5 ml·kg－1对小鼠胚胎全身主要骨骼无发育毒性。

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