甘肃肃南牧区传统发酵乳中乳酸菌的分离鉴定

张 敏，余群力，张 丽

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070）

甘肃肃南牧区传统发酵乳中乳酸菌的分离鉴定

张 敏，余群力*，张 丽

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070）

以5份甘肃肃南牧区传统发酵乳制品为原料进行乳酸菌的分离和鉴定，共分离出25株乳酸菌。对其中23株产乳酸的菌株利用形态、生理生化分析和碳水化合物发酵产酸实验进行鉴定。经鉴定得出23株分属为4个属，11个种。其中乳杆菌属［Lactobacillus（L.）］11株，乳球菌属（Lactococcus）6株，明串珠菌属（Leuconostoc）3株，肠球菌属（Enterococcus）3株。具体来说，L.plantarum 6株、L.fermentum 2株、L.brevis 1株、L.minor 2株、L.lactis subsp.lactis 3株、L.lactis subsp.cermoris 3株、L.mesenteroides 1株、L.lactis 2株、E.faecium 1株、E.faecalis 1株、E.durans 1株。L.plantarum占分离菌株的26.1%，是优势菌株。

传统发酵乳，乳酸菌，分离，鉴定

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是能利用葡萄糖（或可利用的碳水化合物）发酵产生大量乳酸的一群细菌。乳酸菌只是一种习惯叫法，并不是微生物分类学上的名称［1］。用乳酸菌发酵食品不产生任何毒素或毒性物质，产生的乳酸及一些特殊的芳香物质既增加了营养价值又赋予了特殊的风味，因此一直被我国人民所喜爱，全国各地均有不同形式的乳酸菌发酵食品在市场销售或民间流传［2-4］。甘肃肃南地区具有非常特殊的地理生态环境，它地处河西走廊中部的祁连山北麓，平均海拔高度2700m左右，属高寒地区，自然生态资源好，草原肥沃，污染少，具有丰富的牦牛奶资源，是甘肃省重要的畜牧业商品基地。当地居民采用千百年来沿袭古老而传统的方法制作发酵乳，生产方法比较简单。在大多情况下，居民经常采用存放发酵奶和鲜奶的相同容器来进行持续发酵，这也导致了当地流行的发酵产品逐渐演变。这些产品不仅风味独特、组织细腻、口感纯正，而且在当地自然温度下存放较长时间还能保证其口感和状态，同时还保存了自然环境中的乳酸菌。本实验对甘肃肃南牧区传统发酵乳进行乳酸菌的分离、鉴定，旨在发现肃南地区所含乳酸菌类群，以期丰富我国的乳酸菌资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

发酵乳 样品采自甘肃肃南牧区5份牧民家庭自制的发酵乳，编号分别为H、I、J、K、M，以无菌操作采集后放入冰盒，带回实验室4℃保存备用；植物乳杆菌（ L.plantarum）、嗜 热 链 球 菌（Streptococcusthermophilus）IFO13957 购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心；MRS培养基、Elliker培养基、脱脂乳培养基、NB培养基、PY培养基、糖发酵培养基、硝酸盐还原实验培养基、吲哚实验培养基、H2S实验、精氨酸产氨实验等培养基以及其他的生化实验试剂 参照《常见细菌系统鉴定手册》［1］、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》［5］、《乳酸细菌—基础、技术和应用》［6］配制；实验所用的试剂 均为分析纯和生化试剂。

BS2000S型电子天平（1/100） 北京赛多利斯天平有限公；手提灭菌锅 上海医用核子仪器厂；PHS-3B精密pH计 上海电磁仪器厂；WS2-134-75电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械一厂；格兰仕微波炉 顺德格兰仕电器实业有限公司；PHILCO冰箱 美国飞歌国际有限公司；SW-CJ-1F型单人双面工作净化台 苏州净化设备有限公司；显微镜上海光学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的分离 从各个样品中分别取1mL接种于脱脂乳培养基上，37℃厌氧培养24h进行增菌。分别取0.2mL增菌液于灭菌后的两个培养皿中，其中一个倾入10～15mL的MRS培养，另一个倾入Elliker培养基，摇匀，于37℃倒置培养48h。选取在MRS培养基上有透明圈的及在Elliker培养基上呈乳白色的单个菌落再进行以下实验。

1.2.2 菌落形态观察 以肉眼观察菌落形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色等。

1.2.3 革兰氏染色和过氧化氢酶实验 取24h培养的乳酸菌疑似菌落制成水涂片，经革兰氏染色后，在10×100倍显微镜下观察，记录样本的颜色和形状。同时，做过氧化氢酶实验。将G+的杆菌或球菌，过氧化氢酶阴性的菌株暂定为乳酸菌的疑似菌落。

1.2.4 乳酸菌的纯化 用接种环挑取经显微观察认定为乳酸菌的疑似菌落，继续划线于MRS培养基上，重复操作，不断纯化直至得到单菌落，再经过镜鉴确认为纯菌株后转接于MRS琼脂斜面上，4℃下保存备用。

1.2.5 产乳酸实验 采用纸层析法进行产乳酸实验。弃去不产乳酸的菌株。参照文献［6］进行。

1.2.6 乳酸菌的鉴定 接触酶实验、碳水化合物发酵产酸实验、葡萄糖产气实验、硫化氢实验、硝酸盐还原实验、吲哚实验、淀粉水解实验、温度实验、产酸实验等，参照文献［1，5-6］进行。根据培养物的反应特性检索《伯杰氏系统细菌学手册》，判定其生物学别［7］。

2 结果与讨论

从甘肃肃南地区牧民家庭中采集的5份传统发酵乳，经分离纯化并结合革兰氏染色、过氧化氢酶实验以及产乳酸实验，共分离出23株乳酸菌，其中杆菌11株，球菌12株。乳酸杆菌多为中央凸起、边缘整齐、不透明状菌落，大小约1～3mm之间，细胞形态有粗杆、长杆、细长状杆、短杆，多数呈链条状排列。乳酸球菌多是边缘整齐，大约0.5～3mm，乳白或者灰白色，圆形隆起，有光泽，电子显微镜下多为球形、卵球形。从培养物中共分离出23株具有上述特征的菌株，将其认定为乳酸菌疑似菌株。

2.1 乳酸杆菌属、种的鉴定结果

实验以植物乳杆菌（L.plantarum）作为参考菌株，把所分离到的11株无芽孢革兰氏染色阳性、不还原硝酸盐、不产硫化氢、不运动、接触酶阴性的杆菌鉴定为乳杆菌属（Lactobacillus）。实验结果见表1。

H1、H4、J2、K1、K5和M5除符合乳杆菌属的特征外，能发酵果糖、甘露醇、山梨醇、纤维二糖、松三糖、蜜二糖、木糖、棉籽糖、海藻糖、七叶灵等，能够在15℃和45℃条件下生长，查《伯杰氏系统细菌学手册》鉴定其为植物乳杆菌（L.plantarum）。

H3和I2能够发酵阿拉伯糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、蜜二糖、棉籽糖、海藻糖和木糖等，不能发酵七叶灵、松三糖和甘露醇等，《伯杰氏系统细菌学手册》鉴定其为发酵乳杆菌（L.fermentum）。

J4能够发酵阿拉伯糖、七叶灵、乳糖、蜜二糖、棉籽糖、木糖等，不能发酵纤维二糖、甘露醇、松三糖、山梨醇以及海藻糖，鉴定为短乳杆菌（L.brevis）。

K2和M4能够发酵纤维二糖、七叶灵、果糖、麦芽糖、松三糖、海藻糖等，不能发酵阿拉伯糖、乳糖、蜜二糖、棉籽糖和木糖等，其生物学特性和微小乳杆菌相近，将K2、M4鉴定为微小乳杆菌（L.minor）。

2.2 乳酸球菌属、种的鉴定结果

2.2.1 乳酸球菌属的鉴定结果 实验以嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）IFO13957作为参考菌株。由表2可知，菌株H2、I3、J5、I1等9株球菌触酶实验阴性、发酵葡萄糖产酸不产气。菌株H5、J3、M3过氧化氢酶实验阴性，发酵葡萄糖产生大量气体，在6.5%NaCl、pH9.6、45℃下均不能生长，鉴定为明串珠菌属的菌株。在同型发酵乳酸球菌中，菌株H2、I3、J1、J5、K3和M2在10℃条件下能生长、45℃不生长、能够生长于0.1%美蓝牛乳，不能生长于6.5%NaCl和pH9.6条件下，其生物学特性与乳球菌属相近，因此鉴定为乳球菌属（Lactococcus）的菌株。菌株 I1、M1、K4在10℃、45℃、6.5%NaCl和pH9.6下都生长，能生长于0.1%美蓝牛乳，将它们鉴定为肠球菌属内的菌株。所以，这12株球菌分别归属于乳球菌属（6株）、肠球菌属（3株）、明串珠菌（3株）。实验结果见表2。

2.2.2 乳酸球菌各属中内种的鉴定结果

2.2.2.1 乳球菌属内种的鉴定结果 菌株H2、J1和K3能发酵乳糖、麦芽糖产酸，不发酵棉籽糖、蜜二糖和松三糖，无运动性。其特性符合乳酸乳球菌乳酸亚种的生物学特性，鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种（L.lactis subsp.lactis）。

菌株I3、J5和M2能够发酵乳糖，不发酵麦芽糖、蜜二糖、松三糖以及棉籽糖，符合乳酸乳球菌乳脂亚种的生物学特性，定为乳酸乳球菌乳脂亚种（L.lactis subsp.cremoris）。

表1 乳杆菌属、种的鉴定结果

表2 乳酸球菌属、种的鉴定结果

2.2.2.2 明串珠属内种的鉴定结果 菌株H5可利用蔗糖产生葡聚糖，能发酵乳糖、蜜二糖和棉籽糖产酸，不发酵阿拉伯糖和麦芽糖，符合肠膜明串珠菌葡聚糖亚种的生物学特性，暂定为肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp.dextranicum）。

菌株J3和M3可利用蜜二糖和蔗糖产酸，不发酵阿拉伯糖。符合乳明串珠菌的生物学特性，暂定为乳明串珠菌（L.lactis）。

2.2.2.3 肠球菌属内种的鉴定结果 菌株I1能发酵松三糖、山梨醇、蔗糖和乳糖产酸，不发酵阿拉伯糖和棉籽糖，无运动性。符合粪肠球菌的生物学特性，鉴定为粪肠球菌（E.faecalis）。

菌株M1能发酵蜜二糖、蔗糖和阿拉伯糖产酸，不能发酵棉籽糖、松三糖和山梨醇，无运动性。符合屎肠球菌的生物学特性，鉴定为屎肠球菌（E.faecium）。

菌株K4能发酵乳糖，不发酵阿拉伯糖、松三糖、棉籽糖、山梨醇、蔗糖和蜜二糖产酸，无运动性。符合坚强肠球菌的生物学特性，鉴定为坚强肠球菌（E.durans）。

3 结论

从5份甘肃肃南地区牧民家庭自制的发酵乳中共分离出23株乳酸菌，经鉴定得出23株分属为4个属，11个种。其中 L.plantarum 6株、L.fermentum 2株、L.brevis 1株、L.minor 2株、L.lactis subsp.lactis 3株、L.lactis subsp.cermoris 3株、L.mesenteroides 1株、L.lactis 2株、E.faecium 1株、E.faecalis 1株、E.durans 1株。乳杆菌属和乳球菌属均是优势菌属，且L.plantarum占分离菌株的26.1%，是优势菌株。

［1］凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法［M］.北京：中国轻工业出版社，1999.

［2］张文羿.青海省海西地区传统发酵山羊乳中乳酸菌得分离及鉴定［J］.中国乳品工业，2006，34（11）：4-8.

［3］国立东.传统乳制品种乳酸菌得分离及性能研究［J］.食品科学，2006，27（3）：60-64.

［4］赵胜娟，赵暄，罗红霞.新疆传统乳制品中乳酸菌的分离鉴定［J］.中国乳品工业，2007，35（11）：8-11.

［5］东秀珠.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001.

［6］张刚.乳酸细菌—基础、技术和应用［M］.北京：化学工业出版社，2007.

［7］D H Bergey，P H A Sneath，John G Holt.Bergeys Manual of Systematic Bacteriology［M］.Williams&Wilkins，1986（2）：1047 -1245.

Isolation and identification of lactic acid bacteria from traditional fermented milk in Sunan prefecture of Gansu province

ZHANG Min，YU Qun-li*，ZHANG Li

（College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

25 strains of lactic acid bacteria were isolated from traditional fermented milk gathering from the herdsmen’s homes in Sunan prefecture of Gansu province.23 strains which produced Lactate were carried out morphological，physiological and biochemistry analysis and carbohydrate fermentation test.The results showed that the 23 strains belonged to 4 categories and 11 species，which were 11 strains of Lactobacillus（L.），6 strains of Lactococcus，3 strains of Leuconostoc and 3 strains of Enterococcus.Specifically，there were L.plantarum（6 strains），L.fermentum（2 strains），L.brevis（1 strain），L.mino（r2 strains），L.lactis subsp.lactis（3 strains），L.lactis subsp.cermoris（3 strains），L.mesenteroides（1 strain），L.lactis（2 strains），E.faecium（1strain），E.faecalis（1strain），E.durans（1strains）.The results obtained showed that L.plantarum was the predominant strain accounted for 26.1% of total isolation.

traditional fermented milk；lactic acid bacteria（LAB）；isolation；identification

TS252.1

A

1002-0306（2010）11-0196-04

2009-11-18 *通讯联系人

张敏（1984-），女，硕士研究生，研究方向：食品科学。

甘肃省兰州市科技项目（2008-1-41）。