活血抗生滴丸对AA大鼠的抗炎与免疫调节作用

张文亮 王淑美* 陈 刚

大鼠佐剂性关节炎（adjuvant -induced arthritis，AA）属免疫性炎症模型，可表现为免疫功能紊乱、细胞因子失调及体内相关激素水平异常等，其组织学特点包括滑膜增生，单核细胞浸润、关节软骨及骨组织破坏，与人类类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）很近似[1]。活血化瘀中药治疗RA有较好疗效[2]。本试验探讨了具有活血化瘀功效的活血抗生滴丸（Huoxuekangsheng Dripping Pills，HXKSDP）对AA模型大鼠炎症发展和免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

清洁级Wistar大鼠50只，雄性，体质量180～220g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，许可证号：SCXKa（渝）20020003。

1.1.2 药物

HXKSDP由川芎、当归、延胡索等药物组成。所有中药饮片购自重庆桐君阁大药房，经重庆医科大学药学院生药学教研室鉴定为正品。中药饮片用乙醇渗漉法提取，工艺条件为12倍量，75%乙醇渗漉，渗漉速度为3mL/min，选用D101型大孔树脂纯化提取物，用1倍量的树脂吸附，5倍量的60%乙醇洗脱，减压浓缩成含生药量10g/mL的浸膏，将浸膏加入溶化的PEG-4000，保持温度98～100℃，滴制成滴丸，包薄膜衣。每克滴丸含阿魏酸不低于3mg。规格：每丸30mg。

环孢素A（cyclosporine A，CsA）由四川抗菌素工业研究所提供，批号：021102。

1.1.3 试剂

弗氏完全佐剂（FCA，1mg/mL高温干燥灭活的结核杆菌），为Sigma公司产品。免疫球蛋白IgG、IgM、IgA 检测用试剂（北京东亚免疫技术研究所），FITC标记的抗鼠CD4+单抗、PE标记的抗鼠CD8+单抗（晶美生物工程有限公司），流式细胞仪（FACS CALIBUR，美国BD公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 造模与分组

无菌条件下于大鼠左后足掌皮下注射FCA 0.1mL。成模率100%。动物免疫后第19天，Wistar大鼠随机分为5组，即HXKSDP生药含量0.63、1.25、2.5g/(kg•d)剂量组、阳性对照CsA10mg/(kg•d)组及模型组给予生理盐水2mL/d，每组10只，1次/d，连续灌胃30d。

1.2.2 对AA大鼠踝关节炎症的影响

采用Volume meter测定大鼠双侧踝关节以下足容积之和，从开始灌胃给药起，每10d量取，与造模前足容积之差值为肿胀度（mL）[3]。灌胃30d后取完整踝关节切片，HE染色后观察大鼠踝关节滑膜组织的改变。

1.2.3 对AA大鼠免疫功能的影响

灌胃后第30天，股动脉取血。处死动物后，称取各组动物脾、胸腺重量，并计算其脏器指数[4]。器官指数=器官湿重/大鼠体质量×100。免疫单扩散法测定外周血中IgG、IgM、IgA含量。流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+及CD4+/ CD8+比值。

1.3 统计方法

2 结 果

2.1 HXKSDP对大鼠AA的抗炎作用

治疗20、30d后，HXKSDP高剂量组和CsA组足肿胀度降低，与模型组比较差异有显著性（P＜0.01），见表1。

HE染色可见模型组大鼠踝关节滑膜增生，滑膜细胞数量增多，体积增大，排列为多层；滑膜下组织水肿、充血、炎性细胞浸润。HXKSDP高剂量组和CsA组大鼠踝关节滑膜组织增生明显减少，炎性反应减轻。

2.2 HXKSDP对AA大鼠免疫功能的影响

给药30d后，HXKSDP高剂量组和CsA组AA大鼠的免疫器官脾和胸腺指数明显降低，与模型组比较差异有显著性（P＜0.01），见表2。

给药30d后，HXKSDP高剂量组和CsA组能够有效地降低血清中IgG 水平，减少CD4+细胞数，升高CD8+细胞数，降低CD4+/ CD8+比值（P＜0.01）。结果提示HXKSDP对AA大鼠体液免疫及细胞免疫均有一定抑制作用，见表3和4。

3 讨 论

大鼠AA模型是一种免疫性关节炎动物模型。炎症以踝关节为重，可侵及足垫、全足，病理改变为滑膜下组织炎症，滑膜增生，血管翳形成和软骨破坏。Ts细胞功能和单核巨噬细胞异常活化在发病中占重要地位，从组织学而言，滑膜炎症的发展是以巨噬细胞核CD4+T细胞占主要地位。且AA大鼠关节组织病理学及血液中的变化与人类RA极其相似。

RA是一种自身免疫性疾病，存在着体液免疫与细胞免疫功能的失调。体液免疫方面，B细胞功能亢进，致使免疫球蛋白分泌失控，大量分泌的免疫球蛋白与相应抗原结合，存在于血液循环中或沉积于关节滑膜等处，致IgA、IgM，IgG升高。细胞免疫方面，CD4+升高，CD4+/ CD8+比值升高在RA的病理机制中起重要作用[4,5]。

表1 HXKSDP对AA大鼠足肿胀度的影响（±s，n=10）

表1 HXKSDP对AA大鼠足肿胀度的影响（±s，n=10）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

肿胀度(mL)治疗前 治疗10d 治疗20d 治疗30d模型组 —— 1.80±0.26 1.77±0.23 1.74±0.31 1.76±0.29 CsA组 10mg/(kg•d)1.79±0.27 1.41±0.27* 1.13±0.22** 1.04±0.18**HXKSDP低剂量 0.63g/(kg•d)1.78±0.19 1.69±0.34 1.66±0.24 1.65±0.31 HXKSDP中剂量 1.25g/(kg•d)1.83±0.28 1.71±0.30 1.46±0.25* 1.39±0.28*HXKSDP高剂量 2.5g/(kg•d)1.82±0.21 1.44±0.31* 1.25±0.19** 1.11±0.23**

表2 HXKSDP对AA大鼠免疫器官的影响（±s，n=10）

表2 HXKSDP对AA大鼠免疫器官的影响（±s，n=10）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

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表3 HXKSDP对AA大鼠体液免疫的影响（±s，n=10）

表3 HXKSDP对AA大鼠体液免疫的影响（±s，n=10）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

组 别 剂量 IgG IgA IgM模型组 —— 26.74±5.16 3.21±0.54 1.93±0.60 CsA组 10mg/(kg•d)13.56±3.68** 2.62±0.56* 1.69±0.49 HXKSDP低剂量 0.63g/(kg•d)22.31±4.76 3.24±0.59 1.90±0.35 HXKSDP中剂量 1.25g/(kg•d)18.13±3.75* 2.73±0.61 1.86±0.42 HXKSDP高剂量 2.5g/(kg•d)15.18±3.41** 2.77±0.60 1.89±0.59

表4 HXKSDP对AA大鼠T淋巴细胞的影响（±s，n=10）

表4 HXKSDP对AA大鼠T淋巴细胞的影响（±s，n=10）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

组 别 剂量 CD4+(%)CD8+(%)CD4+ / CD8+模型组 —— 48.70±6.06 20.38±4.25 2.41±0.31 CsA组 10mg/(kg•d)38.56±5.23** 23.81±4.14** 1.65±0.26**HXKSDP低剂量 0.63g/(kg•d)47.25±5.33 20.78±4.84 2.28±0.40 HXKSDP中剂量 1.25g/(kg•d)45.74±6.20 22.23±2.58 2.04±0.31*HXKSDP高剂量 2.5g/(kg•d)42.33±4.52** 24.07±4.20** 1.73±0.21**

RA属于中医“顽痹”、“骨痹”、“历节病”、“白虎病”、“痹”等范畴，风、寒、湿、热等邪气杂至袭于经络、痹于关节，使气血运行不畅，晚期引起关节强直、畸形。《杂病源流犀浊•诸痹源流》谓：“痹者，闭也，三气杂至，壅痹经络，血气不行，不能随时祛散，故久为痹”。可见RA 与“血瘀”关系密切。RA存在微循环障碍和血液流变学异常，并有随着病程的延长而有逐渐加重的倾向。“血瘀”在RA中的重要性决定了活血化瘀是RA的一个基本治则。叶天士提出痹久不愈，邪入于络，用活血化瘀法治疗。临床上活血化瘀方药如桃红饮、桃红四物汤、血府逐瘀汤、复方丹参注射液等在RA的治疗中已广泛应用并显示出确切的疗效。本实验研究的HXKSDP由川芎、当归、延胡索等中药提取精制组成。其中川芎为血中之气药，兼有祛风通络之功；当归养血活血，使祛瘀而不伤正；延胡索活血行气止痛。

本实验结果表明，HXKSDP能明显减轻AA大鼠的关节肿胀，减轻炎症关节结构的破坏，降低免疫器官脾指数、胸腺指数，能明显降低IgG含量，减少CD4+细胞数，升高CD8+细胞数，降低CD4+/ CD8+的比值。可见该药对AA大鼠具有明显的抗炎和免疫抑制作用，这可能也是活血化瘀中药治疗RA的机制之一。

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