白毛藤对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响△

杨旭东，张杰，杨骄霞

（1.黑龙江省牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.黑龙江省牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011）

白毛藤对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响△

杨旭东1*，张杰1，杨骄霞2

（1.黑龙江省牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.黑龙江省牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011）

目的：探讨Bcl-xl、p53基因在白毛藤诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡中的作用。方法：不同浓度白毛藤作用于MCF-7细胞48h后，荧光显微镜观察人乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡情况，RT-PCR法检测Bcl-xl、p53基因表达量的变化。结果：白毛藤能诱导MCF-7细胞凋亡，并且上调p53和降低Bcl-xl表达。结论：白毛藤抑制人乳腺癌MCF-7细胞细胞增殖，促进凋亡，其机制可能与激活p53、抑制Bcl-xl表达有关。

白毛藤；乳腺癌；细胞凋亡

乳腺癌是全球第二高发的恶性肿瘤，为女性发病率最高的癌症。我国近年来乳腺癌发病率也呈现快速上升趋势。目前临床上治疗手段是以手术和化疗为主。化疗在乳腺癌治疗中占有很重要的地位，但仍存在一定的不良反应和多药耐药性。随着医学水平的不断提高，中药已经成为当今治疗肿瘤的重要手段，其优势在于中药不仅对肿瘤具有抑制作用，不易产生耐药性，而且对机体的损伤和副作用也较小，因而研究中药抗肿瘤作用及其分子机制是我国科学工作者的重要课题之一。白毛藤Solamum lyratumThunb系茄科植物白英的全草，具有清热利湿、消肿解毒的功效［1］。白毛藤作为抗癌中药之一，临床上用于胃癌、肝癌等多种肿瘤的治疗，已有研究表明，白毛藤水提物体外有较强的肿瘤细胞增殖抑制活性［2］，但对其抗癌作用机理阐述并不明确。本研究的目的在于观察白毛藤诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡作用，初步探讨其作用机制，为白毛藤应用于乳腺癌的临床治疗提供一些新的实验依据。

1 材料

1.1 细胞株

人乳腺癌MCF-7细胞细胞株（武汉中美科技有限公司）。

1.2 药物、试剂与仪器

白毛藤全草（购自牡丹江保健大药房），经牡丹江医学院医学与药物研究中心袁晓环教授鉴定；MTT试剂（泰伦生物科技有限公司，批号041025）；Trizol（Sigma公司，批号15596-018）；引物核苷酸片段（上海生工生物技术有限公司）。荧光显微镜（CKX41-F32FL，奥林巴斯）。

1.3 药物处理

白毛藤全草干品20g，粉碎，用400mL双蒸水浸泡30min，加热沸腾60min，倒出液体留用，药渣加200mL双蒸水再煮1次，合并两次煮出液，使其自然冷却，100目筛绢过滤，弃药渣。滤液经15 000 r·min－1，4℃离心20min，上清液用冷冻干燥机冷冻干燥，将干燥物溶解于40mL PBS，0.22μm除菌滤器过滤除菌，得0.5g·mL－1的棕褐色澄清透明溶液，避光冷藏，实验时再稀释为所需要的药物终浓度。

2 方法

2.1 细胞培养与分组

人乳腺癌细胞MCF-7在含10%胎牛血清的DMEM中采用开放式单层贴壁培养，培养条件为37℃，5%CO2，饱和湿度，待细胞生长至80%浓度时，0.25%胰酶消化，每3d更换1次培养液。加受试物前7d将细胞用PBS洗涤后改为含10%去雌激素胎牛血清的无酚红DMEM中培养，以耗尽细胞内储存的雌激素。实验组：用培养液倍比稀释的浓度为4，6，8，16mg·mL－1的白毛藤水提液。对照组：用含MCF-7细胞的培养液。

2.2 细胞凋亡检测

取指数生长期的癌细胞，加入适量0.25%胰蛋白酶液消化细胞，使贴壁细胞脱落。用含10%胎牛血清的培养基制备成浓度为3×105·mL－1的细胞悬液，于6孔板中每孔接种1mL。将普通洁净盖玻片置于37℃、5%CO2培养箱。24h后加入不同浓度的白毛藤；对照组加相同体积的培养液。48h后细胞用胰酶消化，冷PBS（pH7.2）洗3遍，固定液甲醇-冰醋酸（3∶1），4℃固定10min，弃固定液，蒸馏水洗3遍，室温干燥，用5mg·L－1Hoechst33258染色，37℃、5%CO2培养箱中孵育15min，将孔中的盖玻片取出，盖在已滴好甘油的载玻片上，置于荧光显微镜上观察细胞形态并拍照。

2.3 DNA裂解片段分析（DNA ladder）

取指数生长期癌细胞3×105个，加入不同浓度的白毛藤，作用72h后，收集细胞、洗涤，加裂解液50μL，50℃水浴1h；加RNA酶A（10g·L－1）10μL，50℃水浴2h；加2mol·L－1NaCl 60μL，震荡后10 000r·min－1离心5min；取上清置于新的Eppendorf管中，加2.5倍体积的95%乙醇于－20℃沉淀过夜；次日10 000r·min－1离心10min，去上清液，室温晾干，加TE液10μL溶解；2%琼脂糖凝胶40 V电泳，凝胶扫描成像系统鉴定并照相。

2.4 RT-PCR测定Bcl-xl、p53表达

提取肿瘤细胞总RNA，用RT-PCR方法检测肿瘤细胞Bcl-xl、p53基因表达。设计引物如下：bcl-xl引物，上游：5′-CCCAGAAAGGATACAGCTGG-3′；下游：5′-GCGATCCGACTCACCAATAC-3′，扩增片段448bp。p53引物，上游：5′-TTCTCTCCCCAACAATGAGG-3′；下游：5′-TCTGTGAAGCAGCACCATTC23′，扩增片段531bp。β-actin上游引物：5′-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3′，下游：5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′，扩增片段838bp。反应条件：94℃预变性5min；变性30s（94℃），退火30s（58℃），延伸1min（72℃），共30个循环，最后72℃延伸7min。经凝胶成像系统分析，分别计算bcl-xl、p53与内参扩增带荧光强度×面积的比值，得出bcl-xl、p53 mRNA的相对表达量。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 荧光显微镜检测细胞凋亡情况

荧光显微镜观察不同浓度白毛藤作用48h后，可见蓝色深染的凋亡细胞，并可见细胞核碎裂，细胞体积缩小。实验组与对照组比较有显著性差异（P＜0.01），结果见表1。

表1 各组细胞凋亡率（±s）

表1 各组细胞凋亡率（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05

对照组3.41±2.12实验组2 14.64±5.62*4 16.17±8.04**8 20.54±9.02**16 23.42±9.89**

3.2 各组DNA ladder结果

对照组细胞DNA没有片段化，而2，4mg·mL－1白毛藤组细胞72h基因组DNA开始降解，出现模糊的梯状条带，8，16mg·mL－1白毛藤组72 h后基本形成典型的梯状条带，结果见图1。

图1 各组细胞DNA ladder情况

3.3 各组Bc1-xl和p53基因表达情况

与对照组相比，不同浓度白毛藤作用48h后，肿瘤细胞中原癌基因bcl-xl基因表达逐渐降低，抑癌基因p53基因表达逐渐增加，16mg·mL－1组最明显，见图2～3、表2。

图2 各组细胞bcl-xl基因表达

图3 各组细胞p53基因表达

表2 各组Bc1-xl和p53表达情况（±s）

表2 各组Bc1-xl和p53表达情况（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05

-Actin对照组组别剂量／mg·mL－1 Bcl-xl／β-Actin p53／β 0.91±0.05 0.23±0.01实验组2 0.68±0.05*0.31±0.02*4 0.59±0.04**0.43±0.04**8 0.36±0.02**0.64±0.05**16 0.21±0.01**0.75±0.06**

4 讨论

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡（Programed cell death，PCD），是在精密调节下的细胞的主动死亡过程，在个体发育生长过程中起重要作用。细胞凋亡的异常与多种病理生理过程相关，如肿瘤的发生发展、动脉粥样硬化、自身免疫疾病等。bcl基因家族是重要的凋亡调控基因，包括抑凋亡基因bcl-2、bcl-xl和促凋亡基因如bax、bak、bcl-xs等［3］。bcl-xl过表达与肿瘤发生有密切关系，并能抑制化疗等引起的凋亡，而下调其表达则能促进凋亡发生［4］。p53基因为抑癌基因，存在于正常细胞核中，对细胞损伤分化有抑制作用，具有促进细胞凋亡的作用［5］。p53编码多功能的抑癌蛋白p53，主要功能是在检测基因组损伤、启动修复损伤基因组从而维持基因组稳定，在抑制或阻止细胞转化、诱导基因组损伤的细胞凋亡等方面起到决定性作用，从而抑制肿瘤的发生、去除衰老细胞等［6］。

本研究结果显示，白毛藤促进乳腺癌细胞凋亡，浓度越大，作用越明显。白毛藤可以明显上调乳腺癌细胞p53基因mRNA表达，降低bcl-xl基因mRNA表达。实验结果提示，白毛藤诱导乳腺癌细胞凋亡的分子机制可能与调控Bcl-xl和p53基因表达有关。

［1］冯洪钱.民间兽医本草［M］.北京：科学技术文献出版社，1993：307-308.

［2］施文荣，刘艳.白英对人急性早幼粒白血病HL60细胞生长的影响［J］.福建中医学院学报，2002，12（1）：36-38.

［3］Nicholson DW，Thomberry NA.Apoptosis：Life and death decision［J］.Science，2003，299：214-215.

［4］Pena JC，Thompson CB，RecantW，etal.Bcl-xl and bcl-2 expression in squamous cell carcinoma of the head and neck［J］.Cancer，1999，85：164-170.

［5］Tordan J，Galmdo M F，Piehn JH，etal.P53 expression induces apoptosis in hippoocampal Pyramidal neuron cultures［J］.JNeurosci，1997，17：1397-1405.

［6］RILEY T，SONTAGE，CHEN P，etal.Transcriptional control of human p53-regulated genes［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（5）：402-412.

Effect of Solanum Lyratum Thunb on the Apoptosis of MCF-7 Human Breast Cancer Cells

Yang Xudong，Zhang jie，Yang Jiaoxia
（1.Mudanjiang Medical College，Mudanjiang Heilongjiang157011，China；2.HongQi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College，Mudanjiang Heilongjiang157011；China）

Objective：To investigate the effect of Bcl-xl and p53 gene on Human breast cancer MCF-7 cells.MethodsHuman breast cancer MCF-7 cellswere treated with various ofSolanum lyratumThunb，We observed cell apoptosis of MCF-7 cells by fluorescencemicroscope.We detected the levels of Bcl-xl and p53 gene expression in all groups by RT-PCR.ResultsSolanum lyratumThunb has obviously apoptosis-inducing effects on Human breast cancer MCF-7 cells and could effectively decrease the level of Bcl-xl gene expression and recrease the level of Bcl-xl gene expression.ConclusionSolanum lyratumThunb could induce apoptosis of MCF-7 cells probably by regulating Bcl-xl gene expression and regulating p53 gene expression.

Solanum lyratumThunb；Breast cancer；Apoptosis

黑龙江省教育厅科学技术研究项目——白毛藤有效成分诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究（11531398）

*杨旭东，Email：xingzhe01mdj＠126.com

2009-11-23）