黏红酵母 Rhodotorula glutinis微生物油脂提取工艺研究

王 敏 李市场 刘红霞 朱朝阳

(河南科技大学食品与生物工程学院,洛阳 471003)

黏红酵母 Rhodotorula glutinis微生物油脂提取工艺研究

王 敏 李市场 刘红霞 朱朝阳

(河南科技大学食品与生物工程学院,洛阳 471003)

采用酸热耦合超声波法对黏红酵母 Rhodotorula glutinis微生物油脂提取工艺进行研究。选取酸处理时间、沸水浴时间、超声处理时间、超声功率、提取液配比、提取时间、NaCl浓度等 7个微生物油脂提取相关因素,首先通过 Plackett-Burmen试验设计筛选出 3个显著因子:提取液配比 (P=0.010 5)、超声处理时间(P=0.010 5)、酸处理时间 (P=0.036 4)。然后通过 Box-Behnken试验设计,对 3个显著因素进行优化组合,得到最佳工艺条件,即酸处理时间 34 min,超声处理时间 7.5 min,提取液配比 1.9∶1。与原始工艺条件相比,1 g湿菌所得油脂重量从 42 mg增加到 57.33 mg,提高了 36.5%。

黏红酵母 油脂提取 Plackett-Bur men 设计Box-Behnken设计

生物油脂主要包括动物油脂、植物油脂和微生物油脂[1]。其中微生物油脂是单细胞油脂 (Single cell oil,SCO),不仅可以作为食用油,也可以作为新能源,替代日益枯竭的石油[2]。与动、植物油脂相比,它具有生产周期短、不受季节和气候变化的限制、生产成本低以及保护环境等优点[3-4],因此这种新型油脂备受关注,具有广阔的发展前景[5]。

油脂提取技术是影响生物油脂能否被广泛应用的重要因素之一[6]。而微生物油脂属于胞内油脂,其提取首先需要破碎细胞,因此细胞破碎方法至关重要。目前主要采用的细胞破碎方法有酸热法、超声波法、反复冻融法等[7],但对这几种方法的比较及联合使用还鲜见报道。本试验研究了不同的细胞破碎方法对黏红酵母 Rhodotorula glutinis油脂提取的影响,采用有机溶剂(氯仿 -甲醇)法萃取油脂,并通过Plackett-Burmen试验设计和 Box-Behnken试验设计,对细胞破碎及油脂提取过程中的相关因素进行显著性筛选和油脂提取工艺参数的优化。

1 材料和方法

1.1 菌种

黏红酵母 (Rhodotorula glutinis)31596:中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)。

1.2 培养基及培养方法

斜面培养基:在 5°Bé麦芽汁的基础上加入 2%蛋白胨、2%琼脂,pH 5.8,0.7×105Pa灭菌20 min。

种子培养基:在 5°Bé麦芽汁的基础上加入 2%蛋白胨,pH 5.8,0.7×105Pa灭菌 20 min。

发酵培养基 (g/L):葡萄糖:80,蛋白胨:1.8, (NH4)2SO4:1.11,KH2PO4:2.5,pH5.8,0.5×105Pa灭菌 30 min。

种子液制备:250 mL三角瓶装液量 30 mL,从斜面培养基上刮取 3环菌种至瓶内,28℃190 r/min摇床培养 24 h。

发酵培养:250 mL三角瓶装液量40 mL,接入10%种子培养液,28℃190 r/min摇床培养 96 h。

1.3 酵母细胞破碎的处理

酸热法:将发酵液离心集菌,称取 1 g湿菌体,加入 4 mol/L盐酸 10 mL,振荡混匀,室温下放置30 min,然后沸水浴 3 min,立即放于 -20℃速冷。

超声波法:将发酵液离心集菌,称取1 g湿菌体,加入10 mL蒸馏水振荡混匀后,超声处理,功率200W,全程时间 5 min,其中脉冲时间 3 s,间隔时间 4 s。

酸热耦合超声波法:将发酵液离心集菌,称取1 g湿菌体,加入 4 mol/L盐酸 10 mL,振荡混匀,室温下放置 30 min,然后沸水浴 3 min,立即放于 -20℃速冷,最后超声处理,功率200W,全程时间 5 min,其中脉冲时间 3 s,间隔时间 4 s。

1.4 油脂提取与测定

破碎后的菌液,加入 2倍体积的氯仿 -甲醇提取液,振荡混匀,4 000 r/min离心 25 min,取下层氯仿溶液,与等体积 0.15%氯化钠溶液混匀,4 000 r/min离心25 min后,将下层氯仿溶液转移至锥形瓶内,室温自然挥发氯仿 36 h后称重。根据下式计算油质量:

W=W2-W1。

式中:W为油脂的质量/mg;W1为锥形瓶的质量/mg;W2为锥形瓶和油脂的总质量/mg。油脂质量均为 1 g湿菌提取所得。

2 结果和分析

2.1 不同细胞破碎方法对微生物油脂提取的影响

比较了酸热法、超声波法和酸热耦合超声波法 3种不同的细胞破碎方法对微生物油脂提取的影响,从而找出效果最好的细胞破碎方法,结果见图 1。

图1 不同细胞破碎方法对油脂提取的影响

由图 1中可以明显看到,酸热耦合超声波法所得油脂最多,达 42.67 mg。这是因为酸热法主要利用盐酸对细胞壁中糖及蛋白质等成分的作用,使原来结构紧密的细胞壁变得疏松,再经沸水浴及速冷处理,使细胞壁进一步被破坏,细胞破碎效果较好[8-9];而超声波法是一种物理破碎方法,主要利用其对媒质产生的机械振动作用和空化作用,达到破碎细胞的目的。由于酵母细胞的细胞壁比较厚,单一的细胞破碎方法不能达到较好的细胞破碎效果,因此试验选用酸热耦合超声波法来破碎细胞,即利用酸热法对细胞壁的侵蚀作用和超声波的机械、空化作用,油脂提取效果最好。

2.2 Plackett-Burmen试验设计筛选影响油脂提取的显著因素

在采用酸热耦合超声波法油脂提取的过程中,选取酸处理时间、沸水浴时间、超声处理时间、超声功率、提取液配比 (VCHCl3∶VCH3OH)、提取时间和 NaCl浓度等 7个影响微生物油脂提取的相关因素,研究它们对提油的影响。通过用 Plackett-Burmen[10]试验设计从众多的考察因素中快速、有效地筛选出显著因素,供进一步详细研究。

利用 Plackett-Burmen试验设计,对上述 7个因素进行研究,每个因素分别选取 2个水平:低水平“-1”和高水平“+1”,响应值为最后所得油的质量(mg)。表 1列出了因素的编码及水平,X1～X9分别编码了 9个因素,其中 X3和 X6是空项用于估计误差。试验设计方案及结果见表 2,表中 1～12分别代表 12组试验,按照设计好的方案进行油脂提取试验,每组重复 3次。

表 1 Plackett-Burmen试验设计水平范围

表 2 Plackett-Burmen试验方案及响应值

通过对表 2试验结果进行方差分析可知,超声处理时间 (P=0.010 5)、提取液配比 (P=0.010 4)、酸处理时间 (P=0.036 4)对油脂提取具有显著影响,其他因素不显著。

2.3 Box-Behnken试验设计进一步优化油脂提取工艺

2.3.1 响应面分析因素水平的选取

影响油脂提取的显著因素为酸处理时间、超声处理时间、提取液配比,其他 4个因素在所选水平内,对油脂提取没有显著影响。将非显著因素固定在上述试验低水平的情况下,利用 Box-Behnken[11]试验设计对 3个显著因素进行优化试验。以酸处理时间 (X1)、超声处理时间 (X2)、提取液配比 (X3)为变量,每个变量按低、中、高 3个水平分别以 -1、0、+1进行编码,试验因素及水平见表 3。

表3 响应面分析因素和水平

2.3.2 响应面分析方案及结果

根据表 3的因素和水平,以 X1、X2、X3为自变量,以最后所得油脂质量为响应值 (Y1),试验方案及结果见表 4。表 4中 1～15分别代表 15组试验,其中 13～15为中心试验,重复 3次,用以估计试验误差。按照设计好的方案进行微生物油脂提取试验,每组重复3次。

表4 响应面分析试验方案及结果

2.3.3 模型建立及显著性检验

通过 SAS9.1软件对表 4的结果进行多元回归拟合,获得油脂质量(Y1)对自变量酸处理时间 X1、超声处理时间 X2、提取液配比 X3的二次多项回归模型方程如下:

式中 Y1代表所得油脂重量,X1、X2、X3分别代表酸处理时间、超声处理时间、提取液配比。对该模型进行方差分析,结果见表 5。由表 5可知,对油脂重量所建立的回归模型极显著(P<0.01),模型的失拟项不显著(P>0.05),说明模型可信。且该模型的决定系数 R2=0.993 8,校正决定系数Adj R2=0.982 7,因此该模型能对试验数据进行较好的拟合,可用于分析和预测黏红酵母湿菌体所得油脂质量的情况。

从表 5中还可以看出该模型的一次项、二次项以及交互相的 P值均小于 0.05,说明三因素之间不是简单的线性关系。其中酸处理时间与提取液配比的交互作用极显著,酸处理时间与超声处理时间以及超声处理时间与提取液配比的交互作用显著。并且 X2、X3、X1X1、X2X2和 X3X3对油脂提取的影响均为极显著(P< 0.01),X1为显著(P<0.05),三因素的主效应关系为:提取液配比 >超声处理时间 >酸处理时间。

表5 方差分析表

2.3.4 响应面图及等高线

根据表 5的方差分析可知,三因素对油脂提取均具有显著影响。在保持一个因素为最优条件下,其它两个因素与响应值关系用三维坐标图表示,可以直观反映各因素对响应值的影响关系,见图 2、图3、图 4。

由 3组响应面图可知提取液配比对油脂提取具有显著影响,表现为曲线较陡,而酸处理时间和超声处理时间的曲线则较为平滑。图 2可以看出酸处理时间和超声处理时间都随着时间的延长呈先上升后下降的趋势,图 3、图 4可以看出提取液配比的增长趋势明显高于酸处理时间和超声处理时间。

由 3组等高线图可知圆心处存在极值点,并可直观地看出酸处理时间和提取液配比的交互作用最显著(见图 2),而酸处理时间和超声处理时间、超声处理时间和提取液配比的交互作用与之相比较小(见图 3、图 4)。这是因为等高线的形状能反映交互效应的强弱大小,圆形表示两因素交互作用不显著,而椭圆形则表示两因素交互作用显著。

图 2 响应曲面及等高线图 Y=f(X1,X2)

图 3 响应曲面及等高线图 Y=f(X1,X3)

图 4 响应曲面及等高线图 Y=f(X2,X3)

2.3.5 响应面优化结果及验证

根据响应面分析得到酸热耦合超声波法提取黏红酵母 Rhodotorula glutinis油脂的最佳工艺参数为:酸处理时间34 min,超声处理时间7.5 min,提取液配比 1.9∶1。在此条件下,油脂质量的理论预测值可达到 60.47 mg。

为了验证响应面分析的可靠性,采用上述最佳工艺参数进行验证试验,即酸处理时间 34 min,超声处理时间 7.5 min,提取液配比 1.9∶1,经过 3次平行试验,结果见表 6。实际油脂质量的平均值为57.33 mg,与理论预测值 60.47 mg接近,相对误差为5.48%,证明该回归模型可靠,可以应用响应面法优化黏红酵母油脂提取工艺。

表6 优化条件下的验证试验

3 结论

3.1 通过比较酸热法、超声波法和酸热耦合超声波法对黏红酵母 Rhodotorula glutinis微生物油脂提取的影响,结果显示酸热耦合超声波法效果最好。

3.2 在酸热耦合超声波法提取油脂的过程中,选取酸浸泡时间、沸水浴时间、超声处理时间、超声功率、提取液配比、提取时间、NaCl浓度等 7个微生物油脂提取相关因素,通过 Plackett-Burmen试验设计,以P<0.05为准,筛选出酸处理时间 (P=0.036 0)、超声处理时间(P=0.010 5)、提取液配比 (P=0.010 5) 3个对黏红酵母 Rhodotorula glutinis微生物油脂提取具有显著影响的因素。

3.3 在 Plackett-Burmen试验的基础上,通过Box-Behnken试验设计,对酸处理时间、超声处理时间、提取液配比 3个显著因子进行响应面优化,得到最佳工艺参数为酸处理时间 34 min,超声时间 7.5 min,提取液配比 1.9∶1。与原始工艺条件相比,1 g湿菌中所得油脂质量从 42 mg增加到 57.33 mg,提高了36.5%。

[1]M Canakci,H Sanl.Biodiesel production from various feed2 stocks and their effects on the fuel properties[J].ApplMi2 crobiolBiotechnol,2008,35:431-441

[2]易绍金,郑义平.产油微生物的研究及其应用[J].中外能源,2006,11(2):90-94

[3]QiangLi,WeiDu,Dehua Liu.Perspectives ofmicrobial oils for biodiesel production[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2008,80:749-756

[4]李建,刘宏娟,张建安,等.微生物油脂研究进展及展望[J].现代化工,2007,11(2)133-136

[5]Dominik Antoni,Vladi mir V.ZverlovWolfgang H.Schwarz. Biofuels from microbes[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2007,77:23-35

[6]孙晓璐,孙玉梅,曹芳,等.对产油脂酵母的细胞破碎方法及油脂提取效果的比较[J].河南工业大学学报:自然科学版,2007,28(4):67-69

[7]李植峰,张玲,沈晓京,等.四种真菌油脂提取方法的比较研究[J].微生物学通报,2001,28(6):72-75

[8]张玲,李植峰,谭亚芳,等.一种简便、快速的真菌油脂提取方法[J].生物技术,1999,9(6):43-44

[9]何东平,陈涛,孙松柏,等.丝状真菌发酵生产多不饱和脂肪酸的研究[J].中国粮油学报,2001,16(6):20-25

[10]Plackett R L,Burman J P.The design of optimum multifac2 torial experiments[J].Biometrika,1946,37:305-25

[11]Box G E P,Behnken D W.Some new three level design for the study of quantitative variable[J]s.Technometrics, 1960,2:455-475.

Study on ExtractingMicrobialOil fromRhodotorula glutinis

WangMin Li Shichang Liu Hongxia Zhu Zhaoyang
(Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003)

The technics of extractingmicrobial oil fromRhodotorula glutiniswith acid-heating coupling ultra2 sonic was studied.Firstly,seven influencing factors for extraction rate,i.e.,HCl marinating time,boiling water bath time,ultrasonic treating time,ultrasonic power,ratio of extracting solution(VCHCl3︰ VCH3OH),extracting time, and concentration ofNaCl,were used in Plackett-Burnam design to select three significant factors.Then the three factorswere opti mized by Box-Behnken design.Results:The three significant factors are HCL marinating time (P =0.036 4),ultrasonic time(P = 0.010 5)and ratio of extracting solution (VCHCl3︰ VCH3OH) (P= 0.010 5).The optimized extraction conditions are HCl marinating time 34 min,ultrasonic treating ti me 7.5 min, and ratio of extracting solution(VCHCl3︰VCH3OH)1.9:1.The oilweight of 1 gwet thalli increases from 42 mg under original conditions to 57.33 mg under the optimized conditions,an increment by 36.5%.

rhodotorula glutinis,extracting oil,Pplackett-Bur men design,Box-Behnken design

Q939.97 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2010)06-0071-05

中国科学院等离子体物理研究所暨安徽省离子束生物工程学重点实验室开放基金(2008B004)

2009-06-15

王敏,女,1984年出生,硕士,高产油脂菌株的选育

李市场,男,1976年出生,博士,副教授,硕士生导师,微生物育种