运动频率和递增强度运动对大鼠海马神经发生的影响

娄淑杰,刁 玮,陈佩杰

运动频率和递增强度运动对大鼠海马神经发生的影响

娄淑杰,刁 玮,陈佩杰

目的:探讨运动频次和隔周递增强度运动对大鼠海马神经发生的影响。方法:将60只雄性5周龄SD大鼠随机分为安静对照(C)组、每天运动 (E0)组、隔1日运动(E1)组、隔3日运动(E3)组、隔周运动(E7)组和隔周递增强度运动(E7I)组。运动方式为跑台运动。腹腔注射BrdU于各组大鼠,持续注射6天。采用免疫组织荧光染色技术,检测各组大鼠海马齿状回内新生细胞和新生神经元数量。结果:各组动物海马齿状回内BrdU免疫阳性(BrdU+)细胞数目为:C组37.62±9.02,E0组46.01±10.82,E1组49.06±12.07,E3组41.20±11.02,E7组37.23±16.45,E7I组53.97±10.67。各组大鼠海马齿状回内BrdU和NeuN免疫双阳性(BrdU++NeuN+)细胞数分别为:C组 15.26±4.42;E0组17.61± 3.86,E1组21.93±5.60,E3组16.28±5.37,E7组 15.80±7.50,E7I组24.99±5.44。结论:在间隔不同时间的小强度运动中,隔日小强度运动最有利于大鼠海马齿状回神经发生;隔周递增运动强度也有利于大鼠海马齿状回神经发生。

BrdU;NeuN;神经发生;海马;鼠;动物实验

神经发生过程包括细胞增殖、迁移、分化和存活等几个重要环节,每个环节都可能会影响到新生细胞和新生神经元的最终数目。1992年,Reynodls等从成年小鼠脑纹状体中分离出能够在体外不断分裂增殖且具有多种分化潜能的细胞群,并提出了神经干细胞这一概念[14]。成年哺乳动物的神经干细胞主要存在于中枢神经系统,其中有两个最主要的神经干细胞聚集区,即侧脑室壁的脑室下层和海马齿状回的颗粒下层[9,10]。丰富的环境、适度运动、脑缺血等都可一定程度的诱导海马齿状回部位的神经发生[11,15,16]。本课题组在之前的研究中发现,持续 7天的小强度跑台运动即可明显诱导幼龄大鼠海马齿状回神经发生,但大强度持续运动 7天则缺失诱导海马神经发生效应[3]。如何控制运动强度、运动时间和运动频次才能更好地持续发挥运动的促进神经发生效应呢?鉴于此,本研究通过免疫组织荧光染色方法,观察了不同运动间隔时间和递增运动强度对大鼠海马齿状回新生细胞数量的影响,以及新生细胞分化为神经元的情况,探讨促进神经发生的最适宜运动方式,从而为通过合理运动以促进脑发育和提高脑功能提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组

健康雄性5周龄Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,购买于上海西普尔-必凯实验动物有限公司,平均体重为(106.50±5.46)g。将其随机分为6组,分别为安静对照组(C)、每天运动(E0)组、隔1日运动组(E1)、隔3日运动(E3)组、隔周运动(E7)组和隔周递增运动强度(E7I)组。每组10只。动物分笼饲养,每笼5只,自由饮食,光照时间为7:00～19:00,饲养环境温度为20℃±2℃。

1.2 运动方案及注射BrdU

采取递增负荷跑台运动,运动强度的建立依据Bedford模型[7],并结合实际情况加以调整。运动方案分别为:1)小强度运动:首先以5m/min的速度运动5 min,接着速度加至8 m/min持续5 min,最后以11 m/min的速度持续跑20 min。2)中强度运动:首先以8 m/min的速度跑5 min,接着速度加至11 m/min持续5 min,最后以14 m/min的速度运动20 min。3)大强度运动:首先以8 m/min的速度跑5 min,接着速度加至11 m/min持续5 min,最后以22 m/min的速度运动20 min。除了隔周递增运动强度组,即第1周为小强度运动,第2周为中等运动强度,第3周为大强度运动,其他各运动组动物都采用小强度运动。每天固定时间段在跑台上运动 30 min。BrdU腹腔注射(50 mg/kg体重)在动物跑台运动前1 h完成,在实验的最后6天持续注射,每天1次。

1.3 动物取材和免疫荧光双标计染色

腹腔注射10%的水合氯醛(35 mg/100 g体重)麻醉大鼠,然后将其固定于手术台上,打开腹腔,暴露心脏,从心脏左心室尖处依次灌注0.9%的生理盐水和4%的多聚甲醛。固定后断头,取出脑组织放入4%多聚甲醛中进行后固定过夜。次日再移入15%蔗糖溶液中约12 h,脑组织沉底后再移入30%蔗糖溶液中30 h以上,待脑组织再次沉底后用于制作冰冻切片,切片厚度为25μm,使用BrdU抗体(1∶600,大鼠来源,Gene Tex公司)、NeuN抗体(1∶100,小鼠来源,Milli Pore公司)及罗丹明和 FITC分别标记的二抗(1∶100,Santa Cruz Biotechnology公司),按常规方法对脑组织切片进行免疫荧光标记染色。

1.4 数据采集和统计学分析

通过倒置荧光显微镜(LEICA DM IRB)和莱卡图像分析软件(Qwin V3)进行图像采集处理。每只大鼠海马部位每隔3张选取1张脑切片,共6张,在100放大倍数下对海马齿状回分别进行BrdU+免疫阳性细胞计数和BrdU+/ NeuN+细胞计数,结果采用整个图像平面视野内的BrdU+细胞个数和BrdU+/NeuN+细胞个数表示;然后以每个大鼠6张切片中所标记的BrdU+细胞的平均数表示该大鼠海马齿状回新生细胞数,以每个大鼠6张切片中所标记的BrdU+/NeuN+细胞的平均数表示该大鼠海马齿状回新生细胞分化为神经元的数量。所有数据均以均数±标准差表示。使用SPSS 11.5统计软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),以判断多组间的显著性差异。P <0.05表示有显著性差异。

2 结果

免疫荧光实验中与BrdU抗体发生结合反应的第二抗体为罗丹明标记的山羊抗大鼠 IgG,它在激发状态下发出红色荧光,标记新生细胞;与NeuN抗体发生结合反应的第二抗体为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG,它在激发状态下发出绿色荧光,标记神经元。由于BrdU和NeuN在神经细胞中的着色位置都是在细胞核内,所以细胞如果既呈BrdU+又呈NeuN+,则红色与绿色相叠加呈橘黄色荧光,标记新生神经元(图1)。

图1 大鼠海马齿状回内免疫荧光染色标记BrdU和NeuN染色图Figure 1. Immunofluorescence Staining of the Dentate Gyrus of Hippocampus in SD Rats

图2所示为各组大鼠海马齿状回BrdU+细胞数目:C组为37.62±9.02;E0组为46.01±10.82;E1组为49.06 ±12.07;E3组为41.20±11.02;E7组为37.23±16.45; E7I组为53.97±10.67。其中,E0组BrdU+细胞数量较C组增长了19.61%,E1组较C组增加了30.40%,E7I组较C组增加了43.46%。图3所示为几组大鼠海马齿状回BrdU++NeuN+细胞数:C组为15.26±4.42;E0组为17.61±3.86;E1组为 21.93±5.60;E3组为16.28± 5.37;E7组为15.80±7.50;E7I组为24.99±5.44。其中,E0组BrdU++NeuN+细胞数量较C组增长了15.39%, E1组BrdU++NeuN+细胞数量较C组增加了43.70%,E7I组较C组增加了63.76%。

图2 各组大鼠海马齿状回内BrdU+细胞数量比较图Figure 2. Comparison for the Number of BrdU+Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Rats

图3 各组大鼠海马齿状回内BrdU+/NeuN+细胞数量比较图Figure 3. Comparison for the Number of BrdU+/NeuN+Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Rats

3 讨论

运动对机体结构和功能的影响,源于运动对机体的刺激作用,机体通过对刺激产生反应而产生对运动的适应,所以不同的运动频率和运动强度会对机体产生不同的影响。顾丽燕等研究发现,与每周3次的无负重游泳相比,每周6次的无负重游泳能引起大鼠血清丙二醛含量降低,血清总抗氧化能力上升[2],提示运动引起的机体抗氧化效应增强需要一定的运动频率。Schweitzer等发现,无论一周两次还是隔日转轮运动,与对照组相比都可以明显提高大鼠的空间学习和记忆能力,可明显改变与神经发生相关的基因表达[13],但不同运动频率对幼龄大鼠海马神经发生的影响还未见报道。本研究分别观察了每日、隔1日、隔3日和隔周跑台运动对大鼠海马神经发生的影响,发现每日和隔1日跑台运动皆可明显大鼠诱导海马神经发生,且以隔1日跑台运动的促神经发生效应最明显,但隔3日和隔周跑台运动则对海马神经发生没有明显影响。关于运动诱导神经发生的机制,研究发现与多种神经营养类因子相关,如与运动引起BDNF、VEGF、EPO、谷氨酸受体等基因表达和蛋白合成增加有关[6-8]。在本研究中,隔3日和隔周运动虽然可对机体产生刺激,但因为运动间隔时间过长,使运动诱导神经发生相关因子生成量不足以持续几天刺激神经干细胞增殖。而隔日运动既可保持运动对机体的有效刺激作用,诱导神经发生相关因子的表达,又由于间隔时间短从而可维持有效浓度,此可能是隔日运动可获得明显促神经发生效应的原因所在。

以前研究发现,同一强度持续运动2周引起的大鼠海马神经发生水平较持续运动1周要低[7],分析是机体对运动产生了适应,使得运动的刺激性减弱,导致机体产生的反应性有所降低,而要获得持续的刺激作用,就要不断增加运动强度。为此,本研究比较了C组、E0组和 E7I组神经发生情况,发现E0组和E7I组与C相比,大鼠海马齿状回BrdU+细胞及BrdU++NeuN+细胞数量显著增加,而且E7I组大鼠海马齿状回BrdU+细胞和BrdU++NeuN+细胞数量也高于 E0组,提示合理递增运动强度可克服机体对运动所产生的适应,有利于维持运动对大鼠海马神经发生的促进效应。与此相一致,8周递增运动强度的有氧训练可明显增加VEGF在成年大鼠海马CA3区的表达[1];10天和6周递增负荷游泳运动可增加大鼠海马神经元表达BDNF[4,5]。所以,要获得运动的促神经发生效应,既要考虑到运动频率,也要考虑到运动强度,核心是要维持运动对机体的有效刺激作用。

4 结论

1.运动对大鼠海马神经发生的促进作用依赖于适度的运动频率,本研究中以隔日小强度运动效果最明显。

2.隔周递增运动强度可克服机体对同一运动强度产生的适应,从而维持运动对机体的有效刺激作用。

[1]党利龙.运动训练对大鼠海马CA3区VEGF表达的免疫组织化学研究[J].西安体育学院学报,2007,24(5):61-63.

[2]顾丽燕,章岚,张一民.不同游泳运动对大鼠血清MDA、SOD、TAOC的影响[J].武汉体育学院学报,2004,38(3):28-31.

[3]刘瑾彦,娄淑杰,陈佩杰.跑台运动对幼龄大鼠海马齿状回区神经再生的影响[J].中国运动医学杂志,2006,25(2):171-175,

[4]满君,田野,高颀.过度运动对海马神经元形态及脑源性神经营养因子表达的影响[J].中国运动医学杂志,2004,23(5):510-512.

[5]张卫东.运动对海马和纹状体脑源性神经营养因子及胶质纤维酸性蛋白表达诱导作用的研究[J].南阳师范学院学报,2007,6 (3):51-54.

[6]CHEN L,GONG S,SHAN LD,et al.Effects of exercise on neurogenesis in the dentate gyrus and ability of learning and memory after hippocampus lesion in adult rats[J].Neurosci Bull,2006, 22(1):1-6.

[7]CHEN Z Y,ASAVARITIKRAI P,PRCHAL J T,et al.Endoge-nous erythropoietin signaling is required for normal neural progenitor cell proliferation[J].J Biol Chem,2007,282(35):25875-25883.

[8]FARMER J,ZHAO X,VAN PRAAG H,et al.Effects of voluntary exercise on synaptic plasticity and gene expression in the dentate gyrus of adult male Sprague-Dawley rats in vivo[J]. Neuroscience,2004,124(1):71-79.

[9]GAGE FH.Mammalian neural stem cell[J].Science,2000,287 (5457):1433-1438.

[10]JOHANSSON C B,MOMMA S,CLARKE D L,et al.Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system[J].Cell,1999,96(1):25-34.

[11]KEMPERMANN G,KUHN H G,GAGE F H.More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment[J].Nature,1997,386(6624):493-495.

[12]LOU S J,LIU J Y,CHANG H,et al.Hippocampal neurogenesis and gene expression depend on exercise intensity in juvenile rats[J].Brain Res,2008,1210:48-55.

[13]SCHWEITZER N B,ALESSIO H M,BERRY S D,et al.Exercise-induced changes in cardiac gene expression and its relation to spatial maze performance[J].Neurochem Int,2006,48(1):9-16.

[14]REYNOLDS B A,WEISS S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system[J].Science,1992,255(5052):1707-1710.

[15]VAN PRAAG H,KEMPERMANN G,GAGE F H.Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus[J].Nat Neurosci,1999,2(3):266-270.

[16]ZHANG R L,ZHANG Z G,CHOPP M.Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone[J].Neuropharmacology,2008,55(3):345-352.

Effect of Exercise Frequency and Increasing Intensity Exercise on Hippocampal Neurogenesis in Rats

LOU Shu-jie,DIAO Wei,CHEN Pei-jie

Objective:To investigate effects of movement frequency and incremental exercise intensity on hippocampal neurogenesis in rats.Methods:Sixty male SD rats of 5-week-old were randomly divided into 6 groups:The sedentary control(C)group,the everyday exercise(E0) group,the every other day exercise(E1)group,the every three days exercise(E3)group,the every other week exercise(E7)group and the every other week increasing intensity exercise (E7I)group.All rats except C group were forced to run on treadmill.Immunofluorescence staining was used to evaluate the level of neurogenesis.Results:The number of BrdU positive cells in dentate gyrus of hippocampus was 37.62±9.02 in C group,46.01±10.82 in E0 group,49.06±12.07 in E1 group,41.20±11.02 in E3 group,37.23±16.45 in E7 group,53.97±10.67 in E7I group,respectively.Conclusions:Among all small intensity exercises which have different exercise frequency,the every other day exercise is most benefit of hippocampal neurogenesis in SD rats,the every other week increasing intensity exercise also is benefit of hippocampal neurogenesis in SD rats.

B rdU;NeuN;neurogegesis;hippocampus;rat;animal ex periment

G804.2

A

1000-677X(2010)01-0066-04

2009-08-11;

2009-11-30

国家自然科学基金资助项目(30570899);上海市重点学科建设项目(S30802)。

娄淑杰(1963-),女,内蒙古人,副教授,博士,主要研究方向为运动与脑健康,Tel:(021)51253243,E-mail:shujielou319@yahoo.com.cn。

上海体育学院运动科学学院,上海200438

Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China.