10-HDA对原代培养大鼠海马神经元增殖的研究

田 静,钟方旭

10-HDA对原代培养大鼠海马神经元增殖的研究

田 静,钟方旭＊

(武汉工业学院生物与制药工程学院,湖北武汉430023)

研究10-HDA对原代培养新生大鼠海马神经元的增殖效果.原代培养24 h的新生大鼠海马神经元,通过添加不同浓度的10-HDA(0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L)作用后,利用BrdU免疫荧光染色检测神经细胞增殖,尼氏染色观察神经元数量的变化.结果显示中剂量浓度(1.0μmol/L)的10-HDA作用海马神经元24h后,细胞数量明显增多;而高浓度(10μmol/L)10-HDA作用海马神经元24 h后,细胞数量明显低于正常对照组和低剂量组(0.1μmol/L).BrdU免疫荧光染色表明,中剂量浓度的10-HDA可使细胞增殖,增殖率达到(19.37±2.192 1)%.尼氏染色结果表明,10-HDA使海马神经元数量增加了(20.31±4.086 5)%.研究结果表明,10-HDA对原代培养的海马神经元有增殖作用.

10-HDA;海马细胞;增殖

已有相关研究表明ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)在智力发育和记忆中有重要作用,从而受到广泛的关注[1,2],目前公认参与记忆痕迹的结构是海马组织[3].现已发现DHA对视觉、认知、记忆有重要作用[4].10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)为蜂王浆中含有的特殊活性物质,具有多种生理活性,抗菌、灭菌、强壮肌体以及抑制小鼠白血病和腹水癌功能[5].10-HDA也为ω-3多不饱和脂肪酸的一种,其是否也对认知记忆等方面与DHA有着类似的作用尚不清楚,本文以新生大鼠海马神经细胞元代培养为模型,研究10-HDA对海马神经细胞发育的作用.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

新生24 h的SD大鼠,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.

1.1.2 主要试剂

DMEM/F12培养基、B-27 Serum-Free Supplements、新生牛血清、青霉素、链霉素、DAPI显色液均购自Gibco,多聚赖氨酸、胰蛋白酶购自Sigma,焦油紫购自Invitrogen,BrdU抗体、兔抗鼠二抗购自BD biosciences.其余试剂均为分析纯购自国药集团化学试剂有限公司.

1.1.3 仪器

CO2培养箱、解剖显微镜(XTL-3A)、倒置显微镜及照相系统(Leica,DMI 3000B).

1.2 方法

1.2.1 原代新生大鼠海马神经元的培养

选取新生24 h的SD大鼠数只,雌雄不限,75%酒精全身消毒,断头处死,无菌条件下剥离头皮、颅骨,划开大脑颞叶皮层,小心夹出海马组织,置于冰浴的解剖液(p H7.2,1 g/L含KCl 0.4 g,KH2PO40.06 g,NaCl 8.0 g,NaHCO30.35 g,Na2HPO40.08 g)中,仔细剔除微血管及海马组织外薄膜,冲洗2次,将组织剪碎约1 mm3.加入同体积0.125%的胰蛋白酶,瓶口用锡箔纸盖上,37℃培养箱内消化15 min,制成单细胞悬液. 0.4%台盼兰染色计数活细胞,以1×105/mL的细胞密度接种于用0.1 g/L的多聚赖氨酸预包被培养皿中(每皿2 mL),置37℃,体积分数5%CO2的培养箱中培养.24 h后用维持培养基(DMEM/F12培养基, 2%B27 Serum-Free Supplements)换液1次,48 h后加入阿糖胞苷(终浓度5μg/mL)抑制非神经元细胞增殖.第3天开始用维持培养基每周换液3次,每次换半液.

1.2.2 10-HDA剂量分组

参照Okuda等[6]方法,将10-HDA标准液(Sigma)配制成10 mmg/L储备液,除菌后置于-20℃冰箱备用.将神经细胞分为4组,低剂量组(0.1μmol/L)、中剂量组(1.0μmol/L)、高剂量组(10μmol/L)和空白对照组.将前述细胞悬液接种于培养皿(每皿放置预先用多聚赖氨酸处理的盖玻片),37℃,5%CO2培养箱中,2 h后分别添加不同剂量10-HDA,用于其后实验.

1.2.3 BrdU免疫荧光检测海马神经元增殖

细胞接种2 h后添加不同剂量10-HDA,24 h加入BrdU(终浓度为3μg/mL),37℃培养箱中孵育2 h～4 h.PBS冲洗,2%多聚甲醛固定30 min后,2 mol/L HCl处理30 min,0.1 mol/L硼酸钠中和,5%山羊血清封闭1 h,加BrdU抗体(1∶100),室温1 h;再加入兔抗鼠二抗,室温孵育1 h.每张细胞爬片滴加DAPI溶液(终浓度1μg/mL),3 min,PBS冲洗,晾干.

计算公式为:

1.2.4 神经元尼氏染色

细胞培养7 d后,取出细胞爬片,PBS冲洗3次,用4%多聚甲醛固定细胞爬片15 min.双蒸水洗爬片3次,每次3 min.滴加0.1%焦油紫溶液后,置于25℃恒温箱内浸染30 min.冷却后用自来水、双蒸水各洗1次,每次3 min.以75%的乙醇迅速分化,无水乙醇脱水,二甲苯透明.在光学显微镜下观察并记录:在高倍视野下,随机取10个视野,计数神经元数和细胞总数,计算神经元比例.

计算公式为

1.2.5 图像分析与数据统计

所有细胞图片均随即选择10个视野,组间比较采用单因素方差分析.

2 结果与讨论

2.1 培养大鼠海马神经元形态特点

在倒置显微镜下,刚刚分离出的海马神经元成圆形,周围有明显的细胞膜包围,内部遮光,外部有光晕,体积较小,单个均匀分布于培养皿.培养2 h后,个别细胞开始贴壁,神经元由圆形变为梭形,且伸长出1-2个突起;24 h后,细胞大部分贴壁,细胞形态发生多样化,呈梭形、三角形、锥形或者不规则的形状,突起明显增多、伸长.48 h后,细胞继续伸长,突起延伸,有一个明显的较长较大的和几个较小的突出.加入阿糖胞苷抑制神经胶质细胞的增殖后,神经元周围的神经网迅速丰富,培养7 d后,神经元突起已经变粗变长,并出现明显的分支,形成密集的神经网络(P284图1).

2.2 不同浓度10-HDA培养海马神经细胞BrdU免疫荧光检测细胞增殖结果

接种24 h后,神经细胞大部分均贴壁生长,一些已长出突起,空白对照组突起数目较少而且较短.

低剂量组中神经细胞突起和细胞数量与空白对照组相比无明显变化.中剂量组中,神经细胞数量有明显的增多,增殖率达(19.37±2.192 1)%,并且神经细胞突起有明显的增长(P284图2和3).但高剂量组中, 10-HDA抑制了神经细胞突起的生长,并且细胞数量较空白对照组有所下降,发生死亡,组间比较差异显著(P<0.05).因此,神经细胞培养基中10-HDA的适宜浓度为1.0μmol/L.

2.3 尼氏体染色

正常健康的海马神经元胞浆呈蓝紫色,尼氏小体丰富,且着色较深,结构清晰.非神经元细胞胞浆呈淡紫色或无色.通过尼氏染色,神经元比例可达70%以上,(P284图4).接种2 h后添加10-HDA,培养7 d后,明显发现,中浓度组(1.0μmol/L)中神经元数量明显比其他组增多,增加率为(20.31±4.086 5)%图5. (P<0.05).

图1 培养7d后的海马神经细胞(400×)Fig.1 Hippocampal neurons after 7day’s culture(400×)

图2 BrdU免疫荧光染色(1.0μmol/L) (红色-BrdU阳性细胞,蓝色-DAPI阳性细胞)Fig.2 Hippocampal neurons stained immunohistochemically for BrdU(1.0μmol/L)(Red-BrdU-positive cells,Blue-DAPI-positive cells)

图3 不同浓度10-HDA对海马神经细胞数量的影响(培养24 h)Fig.3 Effect of 10-HDA on the amount of hippoampal neurons(after 24 h culture)

图4 培养7d的海马神经元尼氏染色Fig.4 Nissl’s staining of the the hippoampal neurons after 7 d culture

3 结论

本实验严格控制胰酶的量和消化时间,采用了0.125%胰蛋白酶低浓度溶液、15 min消化的方法,尽可能减少分离过程中的化学损伤.在细胞种植24 h后,换用B27无血清维持培养基,可以选择性的促使神经元生长,抑制非神经元的生长和繁殖[7],从而可以纯化海马神经元.尼氏体是神经元的特征性结构之一,存在于神经元胞体和树突内,可被碱性染料染成深色的颗粒和斑块,是细胞内的一种蛋白质合成物质,并作为观察神经细胞功能的直接指标.本实验通过尼氏染色,观察培养的海马神经细胞状态良好,神经元数量有所增加.利用BrdU的特殊结构,可与细胞中新合成的DNA结合,只要细胞不消亡, BrdU即可在细胞核的DNA中长期留存,并通过抗BrdU单克隆抗体在细胞爬片上显示的原理,利用BrdU免疫荧光染色,鉴定神经细胞的增殖情况.

目前国内外研究仅限于对蜂王浆的整体研究,少有对细胞增殖方面的报道[10-12].本研究通过添加蜂王浆中的活性成分10-HDA,在细胞水平上通过对海马神经细胞生长状况、细胞增殖情况进行观察和测量,研究10-HDA对神经细胞生长发育及增殖的影响.结果表明:10-HDA对海马神经细胞的生长发育及增殖有明显的促进作用,这种影响与10-HDA剂量有关,适量10-HDA可促进神经细胞生长发育及增殖,过量则起抑制作用.虽然目前对前体细胞性质的认定还存在一定的争议,一部分人认为这些细胞就是神经干细胞,另一部分人则认为是神经祖细胞[13].通过BrdU免疫荧光染色发现,10-HDA可能还促进了神经元部分前体细胞的分裂增殖,使神经细胞的数量增加,所以在刚出生的哺乳动物脑内也可能存在这类前体细胞.

图5 不同浓度10-HDA对海马神经元数量的影响(培养7 d)Fig.5 Effect of 10-HDA on the amount of hippoampal neurons(after 7d culture)

海马与大鼠空间记忆以及海马分支程度与海马突触密切相关[8,9].海马神经细胞增多,神经网络密集可增加神经细胞之间枢纽的形成,因而添加10-HDA对神经细胞的影响可以作为增强学习以及认知的细胞形态学基础,对神经系统的发育和功能具有重要的研究意义.

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10-HDA on Proliferation of Primary Cultured Neurons in Hippocampus of Rat

TIAN Jing,ZHONG Fang-xu
(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Institute ofTechnology,Wuhan430023,China)

To observe the multiplication effect of primary cultured hippocampal neurons of new born rats, the primary cultured postnatal rat hippocampal neurons was added different concentration of 10-HDA(0.1, 1.0,10μmol/L),then neural cell proliferation was checked by Brdu immunofluorescence staining.Nissl staining was used to observe the quantitative change of neurons.The results shown that the quantity of hippocampal neurons added medium dose 10-HDA(1.0μmol/L)increase obviously after 24 hours,but the quantity of hippocampal neurons added 10μmol/L 10-HDA was lower than the control group and the lowdose group(0.1μmol/L).Brdu immunofluorescence staining shows that medium dose 10-HDA make cells proliferation,growth rate is(19.37±2.192 1)%,Nissl staining shows 10-HDA can increase the amount of hippocampal neurons,rowth rate is(20.31±4.086 5)%.10-HDA can promote the proliferation of primary cultured hippocampal neurons.

10-HDA;hippocampalneurons;proliferation

R151.1;Q501

A

0253-2395(2010)02-0282-04

2009-07-05;

2009-11-14

田 静(1985-),女,硕士研究生,主要从事神经营养研究.E-mail:besttianjing@yahoo.com.cn,＊通讯作者E-mail:zhongfx72@whpu.edu.cn