IL-6-174G/C及CRP+1059G/C基因多态性与新疆哈萨克族代谢综合征及其组分的相关性研究

芮素芳,郭淑霞,唐景霞,张翼华,张景玉,郭恒,杨志明

(新疆地方与民族高发病重点实验室,石河子832002)

IL-6-174G/C及CRP+1059G/C基因多态性与新疆哈萨克族代谢综合征及其
组分的相关性研究

芮素芳,郭淑霞,唐景霞,张翼华,张景玉,郭恒,杨志明

(新疆地方与民族高发病重点实验室,石河子832002)

为探讨IL-6-174G/C及CRP+1059G/C基因多态性与新疆哈萨克族代谢综合征(MS)及其组分的相关性。应用PCR-RFLP方法对新疆哈萨克族MS病例组200例及对照组201例的白细胞介素6基因-174G/C位点及CRP基因+1059G/C位点进行检测。IL-6-174G/C位点MS组与对照组均以GG基因型为主,其频率分别为94%和98.5%,GC基因型频率分别为6.0%和1.5%,CC型在MS组有1例,占0.5%,在对照组未发现。G和C等位基因频率在MS组分别为97.0%和3.0%,两组基因型差异有统计学意义(χ2=5.66,P<0.05)两组间等位基因频率差异有统计学意义(χ2=6.43,P<0.05);CRP+1059G/C位点MS组与对照组以 GG基因型为主,其频率分别为93.0%和99.0%,GC基因型频率在两组分别为7.0%和1.0%,CC纯合子基因型在两组中均未检出。G和C等位基因频率在MS组分别为96.5%和3.5%,两组基因型差异有统计学意义(χ2=9.43,P<0.05),两组等位基因频率差异有统计学意义(χ2=9.24,P<0.05)。IL-6-174G/C和CRP+1059G/C基因多态性与哈萨克族代谢综合征及组分有一定关联。

IL-6-174G/C;CRP+1059G/C;哈萨克族;代谢综合征;基因多态性

Abstract:To study the associations of the gene polymorphism at-174G/C interleukin-6 and C-reactive protein(CRP)+1059 G/C in patients with metabolic syndrome and its components of the Xinjiang Kazakh population.We used PCR-RFLP to detect the frequency of IL-6-174G/C and CRP+1059G/C genotype and alleles in Xinjiang Kazakh residents of Shawan and the Bortala region over 18 years old.The IL-6-174G/C gene frequency of GG in the MS group was 94.0%,GC was 6.0%,CC was 0.5%and the allele gene frequency of G and C was 97.0%and 3.0%,there was statistically significant difference in these gene distributions among MS group and normal group(χ2=5.66,P<0.05),The CRP gene frequency of GG in MS group was 93.0%,GC was 7.0%CC was not found between the two groups,and the allele gene frequencyof Gand C was 96.5%and 3.5%.There were statistically significant differences in these gene distributions among MS group and normal group(χ2=9.43,P<0.05).These results suggest that the interleukin-6 gene-174G/C and CRP+1059G/C polymorphism was associated with metabolic syndrome and its components of xinjiang Kazakh population.

Key words:Kazakh;IL-6-174G/C;CRP+1059G/C;metabolic syndrome

代谢综合征(metabolic syndrome,MS),是以胰岛素抵抗为病理生理基础,以中心性肥胖、高血压、糖代谢及脂代谢异常、高胰岛素血症、高尿酸血症和炎性标志物水平增高等为主要表现的临床综合征。近年来研究已证实炎症因子白细胞介素(IL-6)及C反应蛋白(CRP)与MS的发生密切相关[1-2]。研究发现新疆哈萨克族高血压、糖尿病标化患病率、空腹血糖损害检出率、超重、肥胖比例均明显高于全国的水平,新疆哈萨克族MS的患病率为26.7%[3],但确切的病因和发病机制尚未完全明了,为进一步认识哈萨克族MS的遗传易感性。本研究运用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragmentlength polymorphism PCR-RFLP)方法检测新疆哈萨克族人群 IL-6-174G/C和CRP+1059G/C基因多态性,探讨其与MS及其组分的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

采用分层整群抽样的方法抽取1444名新疆博乐地区和沙湾县18岁及以上哈萨克族居民进行MS现况调查,在此基础上参照2005年国际糖尿病联盟(IDF)对MS的定义[4],随机抽取200例MS患者作为病例组,并从同一人群按成组匹配方法随机抽取非MS者201例作为对照组。

1.2 研究指标

采用调查表对所有研究对象进行问卷调查,内容包括人口学资料、个人疾病史、心脑血管病家族史、吸烟和饮酒史、膳食、运动情况等,并采用标准、规范的方法测量研究对象的血压、身高、体重、腰围、臀围等。实验室检查包括:血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和空腹血糖(FPG)等,以上测定在全自动生化分析仪上进行。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA提取

取研究对象空腹静脉血200μL,采用经典酚-氯仿法提取血液基因组DNA,并用电泳检测抽提结果,完成后放入-80℃冰箱低温保存备用。

1.3.2 PCR扩增

IL-6-174G/C位点引物序列参照文献[5],上游5′TGACTTCAG CTTTACTCTTGT 3′,下游 5′CTGATTGGAAACCTTATTAAG3′;CRP+1059G/C位点引物序列[6],上游5′GATCTGTGTGTGATCTGAGAAACCTCT 3′,下游 5′GAGGTACCAGAGACAGAGACGTG 3′,(引物由大连宝生物公司合成),两位点 PCR反应体系相同均为25μL,其中模板 DNA 为 1.9μL、Buffer 2.5μL、dNTP 2μL、Taq DNA 聚合酶((含 Mg2+,2.5 U/μL))0.6μL、上游和下游引物各为1μL 、ddH2O 16μL(所有试剂均为大连宝生物公司产品)PCR反应条件:IL-6-174G/C位点:94℃预变性5 min,按循环程序94℃变性45 s,56℃复性45 s,72℃延伸1 min共循环35次,再进行72℃终末延伸10 min,结束后-20℃保存;CRP+1059G/C位点:94℃预变性5 min,按循环程序94℃变性45 s,65℃复性45 s,72℃延伸1 min共循环35次,再进行72℃终末延伸10 min,结束后-20℃保存。

1.3.3 聚合酶链反应扩增产物的消化及电泳

1.3.3.1 IL-6-174G/C位点 用NlaⅢ内切酶(购自NEB公司)酶切,反应体系为20μL,其中 PCR扩增产物10μL,10×BSA 缓冲液0.2μL、Buffer 2 μL、NlaⅢ内切酶0.2μL、ddH2O 7.6μL 37 ℃水浴2 h,用3%琼脂糖凝胶电泳1 h,在Bio-Rad凝胶成像仪上观察酶切结果(图1)。

图1 I L-6-174G/C酶切位点的PCR-RFLP检测结果Fig.1 The PCR-RFLP detection result of I L-6-174G/C by NLAⅢendonuclease

IL-6-174G/C扩增产物长度为198 bp,GG型出现2个片段167 bp、31 bp(片段太小不能显示);GC型出现4个片段167 bp、122 bp、45 bp和31 bp(片段太小均不能显示);CC型(122 bp、45 bp、31 bp);从左向右依次为 Marker、PCR产物、GG型(167 bp、31 bp)、CC 型(122 bp、45 bp、31 bp)、GC型(167 bp、122 bp、45 bp 和 31 bp,其中45 bp 和 31 bp片段太小,均不能显示出来)。1.3.3.2 CRP+1059G/C位点 用MaeⅢ内切酶(Roche Diagnostics,Germany)酶切,反应体系为20 μL,其中 PCR扩增产物 10μL,Buffer 12.5μL、NlaⅢ内切酶 0.5μL、ddH2O 7.6μL 55 ℃水浴 1 h,2%琼脂糖凝胶电泳1 h,Golden view染色后,用Bio-Rad凝胶成像系统拍照,酶切结果(图2)表明:CRP+1059G/C扩增产物长度为744bp,GG型出现310 bp、233 bp、201 bp 3个片段,GC型出现434 bp、310 bp、233 bp 和 201 bp 4个片段 ,从左向右依次为 Marker、PCR产物、GC型(434 bp、310 bp、233 bp、201 bp)、GG型(310 bp、233 bp、201 bp)及 GC型(434 bp、310 bp、233 bp、201 bp)。

图2 IL-6-174G/C酶切位点的PCR-RFLP检测结果Fig.2 The PCR-RFLP detection result of CRP+1059G/C by MaeⅢendonuclease

1.4 统计分析

应用 Epidata3.02软件包建立数据库,采用SPSS13.0软件进行统计分析。采用直接计数法计算各等位基因的基因表型频率,组间等位基因表型频率的比较用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义,计算比值比(Odds ratio,OR)估计相对危险度,并计算OR值95%的可信区间(confidence interval,CI)。

2 结果

2.1 MS组与对照组一般情况

见表1。MS病例组中男性112例,女性88例,其平均年龄(50.07±11.56)岁;对照组中男性121例,女性80例,平均年龄(48.23±12)岁。两组年龄均衡(t=1.56,P=0.12)、性别差异无统计学意义(χ2=0.726,P>0.05),两组基因型经检验分布符合 Hardy-Weinberg遗传平衡定律(χ2=0.275,P>0.05),具有群体代表性,可以代表哈萨克族人群。两组间的腰围、臀围、WHR 、TC、TG、LDL-C、HDL-C、FPG、SBP、DBP、BMI的差异均有统计学意义(P<0.01),说明MS各组分在两组之间有差别。

表1 MS组与正常对照组一般情况比较Tab.1 Comparison of MS group and Control yroup Clinical Characteristies

2.2 MS组与对照组 IL-6启动子-174位点基因型和等位基因频率的比较见表2。

表2 MS组与对照组IL-6启动子-174位点基因型和等位基因频率Tab.2 Genotypes and alleles of the IL-6-174G/C betweea MS and Gontrol group

由于两组中有1例CC型,将其合并入 GC组中,所以 GG型和 GC+CC型基因频率分别为96%和3.7%,MS组与对照组频率分别为94%和98.5%,GC基因型频率在两组分别为6.0%和1.5%,G和C等位基因频率分别为96.8%和3.3%;两组间基因型的差异有统计学意义(χ2=5.66,P<0.05),两组间等位基因频率的差异有统计学意义(χ2=6.43,P<0.05)。以 G等位基因为参照,C等位基因的OR为4.12(95%CI:1.38～12.29),这表明携带C等位基因者患MS的危险性是携带 G等位基因的4.12倍。

2.3 MS组与对照组CRP+1059位点基因型及等位基因频率的比较

见表3。两组均以 GG型为主,其频率分别为93%和99%,两组 GC基因型频率分别为7.0%和1.0%,CC型纯合子基因型在两组中均未检出。两组基因型的差异有统计学意义(χ2=9.43,P<0.05),两组等位基因频率差异有统计学差异(χ2=9.24,P<0.05)以 G等位基因为参照,C等位基因的OR值为7.25(95%CI:2.04～25.76),这表明携带C等位基因者患MS的危险性是携带G等位基因的7.25倍。

表3 MS组与对照组CRP+1059位点基因型及等位基因频率的比较Tab.3 Genotypes and Alleles of the CRP+1059G/C between MS and Control group

2.4 IL-6启动子-174位点基因型与MS的关系

见表4。IL-6-174位点 GG基因型与 GC基因型在 TG、HDL-C、LDL-C、FPG上差异无统计学意义(P>0.05),而在腰围、臀围、WHR、TC、SBP、DBP及BMI上差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 IL-6启动子-174位点基因型与MS各组分的关系Tab.4 Association of IL-6-174G/C genotype and Metabolic Syndrome and its Components

2.5 CRP+1059位点基因型与MS的关系

见表5。由表5可知,CRP+1059位点 GG型和 GC型在腰围、臀围、HDL-C、FPG、DBP和BMI上差异有统计学意义(P<0.05)。

表5 CRP+1059位点基因型与MS各组分的关系Tab.5 Association of CRP+1059G/C genotype and Metabolic Syndrome and its Components

3 讨论

人类IL-6基因位于第7号染色体短臂上,含有5个外显子和4个内含子,IL-6基因有许多单核苷酸多态性位点及5′侧翼区域及3′侧翼区域数目变异串联重复等多态性。有研究表明[7],IL-6基因启动子上游第180bp至第123bp区域是IL-6基因转录调控的关键区域。在IL-6基因启动子上游第174位点存在G/C单核苷酸替换多态性,其等位基因多态性可影响IL-6基因的转录和表达,进而影响IL-6与一些相关疾病的发生与发展。国外研究发现IL-6-174位点基因多态性与冠心病、心肌梗塞、2型糖尿病[8]及胰岛素抵抗[9]等易感性和临床表现有关联。国内研究发现IL-6基因-174G/C多态性存在与欧美人种完全不同的频率分布特征及代谢特征,IL-6-174位点基因型和基因频率分布基本相似但个别略有差异。杨翼衡[10]等研究IL-6基因174G/C多态性与胰岛素抵抗的相关性发现中国汉族人群IL-6-174基因位点几乎均为GG基因型,明显不同于欧美人群,C等位基因仅占1.4%,为稀有碱基。本研究发现哈萨克族人群IL-6-174基因位点也以 GG基因型为主,其频率为96.3%,在MS组中发现1例突变纯合子CC型,等位基因C的频率(3.0%)与天津市汉族人(3.6%)较为接近,却明显低于欧美人群(20%～40%),提示IL-6-174位点分布有种族的差异,这种种族间的遗传背景差异有可能招致同一种突变在不同人群产生不同的表型效应。本研究发现哈萨克族MS组 GC基因型发生MS的危险性是对照组GG基因型的4.21倍,以G等位基因为参照,C等位基因的OR为4.12(95%CI:1.38～12.29),说明携带C等位基因者患MS的危险性是携带G等位基因的4.12倍。GG基因型与GC基因型在腰围、臀围、腰臀比、TC、SBP、DBP 及BMI上差异有统计学意义(P<0.05)提示哈萨克族IL-6-174G/C位点基因多态性MS及组分有一定相关性。

近年来研究显示,CRP与MS及其各组分的关系非常密切,胡傲容等[11]研究证实代谢综合征与炎症密切相关,随着MS组分数目增加,hsCRP水平逐渐增高,提示CRP可作为代谢综合征的重要预测指标。国外学者Vicker[12]发现遗传因素影响个体CRP基础水平,1059位点 G等位基因与C等位基因携带者血清CRP基础水平存在差异。本研究发现1059位点 GG型和 GC型在腰围、臀围、HDL-C、FPG、DBP和 BMI上差异有统计学意义(P<0.05),以 G等位基因为参照,C等位基因的OR值为7.25(95%CI:2.04～25.76),说明携带C等位基因者患MS的危险性是携带 G等位基因的7.25倍。聂海等[13]研究CRP与代谢综合征组分及靶器官损害的关系发现,基因多态性与MS组分中的收缩压、腹围、FPG相关,GC基因型与腹围、收缩压、FPG等有关。本研究结果认为CRP+1059位点GG型与 GC型在腰围、臀围、HDL-C、FPG、DBP和BMI比较差异有统计学意义(P<0.01)。本研究结果显示IL-6-174G/C及CRP+1059G/C基因多态性与哈萨克族MS及其组分有一定相关性,尤其是与血压、腰围、臀围、BMI的关系有统计学意义,新疆哈萨克族人群中高血压、高血糖、高血脂及肥胖等健康问题较为突出,因此,及早发现并有效控制哈萨克族人群的血压和腰围水平显得尤为重要。

[1]Pradhan A D,Manson J E,Rifai N,et al.C-reactive protein,interleukin 6,and the risk of developing type 2 diabetes mellitus[J].JAMA,2001,286:327-334.

[2]Fbrez H,Castillo-Florez S,Mendez A,et al.C-reactive protein is elevated in obese patients with the metabolic syndrome[J].Diabetes Research and Clinical Practice,2006,7(1):92-100.

[3]郭艳英,王坤,赵蕾,等.新疆博尔塔拉蒙古自治州维、哈、蒙、汉四民族代谢综合征流行病学调查[J].中华内科杂志,2006,45(3)227-228.

[4]International Diabetes Federation.The IDF consensus worldwide definition of the metabolic syndrome[M].Brussels,Belgium:International Diabetes Federation,2004.

[5]Fernández-Real J M,Broch M,Vendrell J,et al.Interleukin-6 gene polymorphism and lipid abnormalities in healthy subjects[J].J Clin Endo Meta,2000,85(1):334-339.

[6]Henian Cao,Robert A.Hegele Human C-reactive protein(CRP)1059G/C polymorphism[J].Hum Genet,2000,45:100-101.

[7]Terry F C,Loukaci V,Green R F.Cooperative influence of genetic polymorphisms on interleukin-6 transcriptional regulation[J].Biol Chem,2000,275:18138-18144.

[8]Vozarova B,Fernandez-Real J M,Knowler W C,et al.The interleukin-6-174G/C promoter polymorphism is associated with type-2 diabetes mellitus in Native Americans and Caucasians[J].Hum Genet,2003,112:409-413.

[9]Fernandez J M,Broch M,Vendrell M,et al,Interleukin-6 gene polymorphism and insulin sensitivity[J].Diabetes,2000,49:517-520.

[10]杨翼衡,罗国辉,陆泽元.白细胞介素6基因174G/C多态性与胰岛素抵抗的关系[J].中国动脉硬化杂志2005,13(1):101-104.

[11]胡傲容,郭淑霞,张景玉,等.代谢综合征病人的白细胞介素6和高敏C反应蛋白[J].中华高血压杂志,2009,17(12):1117-1119.

[12]Vickers M A,Green F R,Terry C,et al.Genotype at a promoter polymorphism of the interleukin-6 gene is associated with baline levels of plasma C-reactive protein[J].Cardiovasc Res,2002,53:1029-1034.

[13]聂海,祝之明,闫振成,等.高敏C反应蛋白与代谢综合征组分及靶器官损害的关系[J].中华心血管病杂志,2004,32(12):1113-1117.

Association of Interleukin-6 Promoter-174G/C and C-reactive Protein+1059 G/C Polymorphisms with Metabolic Syndrome and its Components in the K azakhs of Xinjiang

RUI Sufang,GUO Shuxia,TANGJingxia,ZHANG Yihua,ZHANGJingyu,GUO Heng,YANG Zhiming
(Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease,Shihezi University,Shihezi 832002,China)

R181.38

A

1007-7383(2010)04-0469-05

2009-01-05

国家科技支撑计划项目 (2009BAI82B04),新疆兵团国际科技合作项目(2009YD33)

芮素芳(1979-),女,硕士生,专业方向为慢性病流行病学。

郭淑霞(1962-),女,教授,从事慢性病流行病学的研究;e-mail:pge888@sina.com。