新疆牦牛多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药物敏感实验

康立超,田亮,张晓宇,王平福,薄新文,马勋

(1新疆农垦科学院,新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,石河子832000;2石河子大学动物科技学院,石河子832003;3新疆兵团农十二师104团,乌鲁木齐 830009)

新疆牦牛多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药物敏感实验

康立超1,田亮2,张晓宇2,王平福3,薄新文1,马勋2

(1新疆农垦科学院,新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,石河子832000;2石河子大学动物科技学院,石河子832003;3新疆兵团农十二师104团,乌鲁木齐 830009)

为确诊新疆某牦牛场的某疾病的发病病源,控制病情蔓延,对该病病原进行分离培养、小白鼠致病性试验、生化鉴定、PCR鉴定。结果表明:得到6株多杀性巴氏杆菌;这6株分离菌均对庆大霉素、四环素、链霉素、磺胺、土霉素等药物敏感;根据多杀性巴氏杆菌 KM T-1基因扩增了1条457 bp的特异性条带,对其进行测序分析,结果表明其与 GenBank提交的12条多杀性巴氏杆菌 KM T-1基因序列同源性达97%～99%。

牦牛;多杀性巴氏杆菌;分离鉴定;药敏试验

Abstract:In order to determine the pathogen and control outbreak the pestilence in some farm of Yak in Xinjiang,fractional cultivation of pathogen,pathogenicity test of mice,identification of biochemistry and physiology and PCR were done.The result indicated that 6 strainsPasteurellosis multocidawere obtained;the 6 strains were sensitive to cidomycin,tetracycline,streptomycin,sulfasulfonamides,oxytetracycline etc.The PCR products were 457 bp and specificity bands ofKM T-1 gene ofPasteurellosis multocida.The homology ofKM T-1 gene was 97%～99%with other ofKM T-1 gene ofPasteurellosis multocidain GenBank.

Key words:yak;Pasteurellosis multocida;isolation identification;sensitive test of drug

巴氏杆菌病(Pasteurellosis)主要是由特定血清型的多杀性巴氏杆菌(Pasteurellosis multocida,Pm)引起畜禽共患的一种烈性传染病。其主要有多杀性巴氏杆菌、溶血性巴氏杆菌和嗜肺性巴氏杆菌等引起,其中以多杀性巴氏杆菌存在较为普遍,能够引起猪肺疫、牛出血性败血症、禽霍乱等多种临床疾病[1]。多杀巴氏杆菌菌体抗原有12个型,荚膜抗原有5个型,血清型众多(16种血清型),在毒力及流行病学等方面的生物学特性差异很大。血清型与宿主的分布有一定关系[2]。其细胞壁含有明显的内毒素活性,但未发现外毒素。巴氏杆菌病呈世界性分布,各种畜、禽乃至野生动物均可发病[3]。

我国先后从11种畜禽的自然病例中共分离出多杀性巴氏杆菌25株,大致可分成Fg和Fo 2个菌株类型。牛、猪、驴和马的该病绝大多数为Fg型菌所致,家禽流行性巴氏杆菌病均由Fo型菌所致[4]。

近2年新疆某牦牛场出现犊牛死亡。其临床症状表现为病初体温高达41～42℃,精神沉郁,呼吸加快,有痛苦性干咳,下痢,气味恶臭。病理变化表现为肺脏表面有肝变区,呈大理石样花纹,有纤维素性胸膜炎变化,有化脓灶;肝肿胀;淋巴结明显水肿出血;个别牛膝关节肿大,发炎化脓。为了确定其病原,本实验对其进行细菌的分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

无菌采取4头濒死犊牛心血、肺、肝、关节液。

1.1.2 培养基

普通琼脂平板、5%兔或羊鲜血琼脂平板、麦康凯平板、LB肉汤,常规生化鉴定培养基[5]等。

1.1.3 菌株

感受态大肠杆菌JM109由新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室保存;多杀性巴氏杆菌(CVCC393)购于中监所;大肠杆菌(ATCC25922)、白色念珠菌(ATCC2002)、链球菌(ATCC55121)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)的昆明动物研究所馈赠。

1.1.4 实验动物

健康昆明系小白鼠32只(16～18 g)。

1.1.5 药敏纸片

参考杭州天和微生物试剂有限公司的纸片浊药敏试验抑制直径料断标准。青霉素钾(10μg/片),四环素(30μg/片),氧氟沙星(5μg/片),庆大霉素(10μg/片),氟苯尼考(30μg/片),诺氟沙星(10 μg/片),阿莫西林(20μg/片),土霉素(30μg/片),氨苄西林(10μg/片),链霉素(10μg/片),磺胺(10 μg/片),卡那霉素(30μg/片)。

1.1.6 主要试剂

pUCm-T vector试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自上海生物工程有限公司。MarkerⅠ、Taq DNA聚合酶和dNTP购自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离培养

病料触片,进行瑞特氏染色、镜检。将病料分别无菌接种到LB肉汤、普通琼脂平板、5%兔或羊鲜血琼脂平板,37℃培养18～24 h,进行细菌的分离纯化培养,纯培养物革兰氏染色。

1.2.2 生化鉴定

挑取纯培养物无菌接种于常规生化鉴定培养基(葡萄糖、靛基质、甘露醇、麦芽糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、果糖、MR、VP、柠檬酸、尿素、H2S、硝酸盐、触酶)中,37℃培养48 h,判断结果。

1.2.3 动物试验

将6株临床分离菌的纯培养物制成菌悬液,每株菌腹腔注射 3只小白鼠(0.2 mL/只,3×109CFU/mL),2只腹腔注射LB肉汤做阴性对照。

1.2.4 药敏试验

将纯化好的细菌用灭菌生理盐水洗下,并且与麦氏比浊管比浊,选取3×109CFU/mL浓度的菌悬液,用灭菌棉拭子均匀涂布鲜血琼脂平板,分别贴上各种药敏纸片,37℃培养24 h判定结果,判定标准参照参考杭州天和微生物试剂有限公司纸片法药敏试验抑菌环直径判断标准。

1.2.5 PCR鉴定

1.2.5.1 引物合成

根据多杀性巴氏杆菌 KM T-1基因(GenBank登录号:AF016259)由上海生物工程有限公司合成引物。上游引物PM1:ATCCGCTATTTACCCAGTGG,下游引物PM2:GCTGTAAACGAACTCGCCAC[6]。

1.2.5.2 PCR模板、反应体系、反应条件

采用碱裂解法提取各个细菌基因组[7]。PCR反应体系(25μL):10×Buffer 2.5μL,25 mmol/L MgCl21μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0μL,10μmol/L上、下游引物各1μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,模板1μL,无菌水16μL。PCR反应条件:95 ℃变性3 min;然后进入30个循环,94 ℃30 s、59 ℃30 s、72℃40 s;最后72℃延伸10 min,PCR产物4℃短时保存。

1.2.5.3 PCR结果观察

取PCR扩增的反应产物3μL,加到含 EB的0.8%琼脂糖胶中,在100 V电压下电泳30 min,然后在凝胶成像系统下观察。

1.2.6 KMT-1基因的克隆

将扩增的PCR产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行回收,回收产物与pUCm-T vector连接,10μL连接体系:10×Ligation Buffer 1μL,pUCm-T vector 1μL,50%PEG4000 1μL,ddH2O 1μL,T4DNA Ligase 1μL,PCR 纯化产物 5μL,16℃连接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109,挑选在含有Amp的LB-琼脂平板上生长的菌落,采用菌落PCR法进行阳性菌落的鉴定。

1.2.7 KMT-1基因的测序及序列分析

挑取阳性菌落在含有Amp的LB肉汤中培养后送往上海生物工程有限公司测序部对pUCm-T vector中的插入片段进行测序。用DNAMAN分析序列并与其他菌株进行同源比较。

2 结果

2.1 病原菌形态学及培养特性

从发病犊牛组织中分离到6株细菌,菌株编号为B1～B6;心血、肝、肺等病料触片,瑞特氏染色镜检,观察到两极浓染的小杆菌(图1)。6株菌纯培养物革兰氏染色为革兰氏阴性小杆菌。在LB肉汤培养24h后浑浊,连续培养2～3 d,液体清彻,管底有粘稠液体;在普通琼脂平板上生长贫瘠;在鲜血琼脂培养基上形成灰白色、圆形、微隆起、半透明、湿润、表面光滑、边缘整齐的露珠样菌落;在麦康凯不生长;在兔或羊鲜血琼脂平板上均不溶血(图2)。

图1 肝抹片(瑞特氏,100ⅹ10)Fig.1 Smear of liver(wright’s 100ⅹ10)

图2 鲜血琼脂平板Fig.2 Agar plate of blood

2.2 生化鉴定结果

从表1可以看出,B1～B6与标准菌株生化鉴定结果基本一致,疑似为多杀性巴氏杆菌。

表1 分离株生化试验结果Tab.1 The result of biochemistry to experiment

2.3 动物试验结果

临床分离株均有强致病性,攻毒小白鼠24～48h全部死亡。从死亡小鼠心血,肝中分离到革兰氏阴性小杆菌。

2.4 药敏试验结果

根据杭州天和微生物试剂有限公司纸片法药敏试验抑菌环直径判断标准,分离菌对庆大霉素(φ=24 mm)、四环素(φ=20 mm)、链霉素(φ=20 mm)、磺胺(φ=28 mm)、土霉素(φ=34 mm)等药物敏感,对其他药物均产生不同程度的耐药性,尤其是卡那霉素(φ=6 mm)。

2.5 PCR扩增鉴定结果

预计扩增片段大小为 457 bp。标准菌株CVCC393(1泳道)和临床分离株B1～B6(4～9泳道)均在457bp处有明显的条带;其它均未扩增出条带(图3)。

图3 多杀性巴氏杆菌PCR鉴定Tab.3 PCR identification of Pasteurellosis multocida

2.6 测序结果

测序结果为457 bp(图4中object yak),与唐先春等[8]报道猪多杀性巴氏杆菌序列大小一致。与GenBank中多杀性巴氏杆菌 KM T-1基因序列比对97%～99%同源性,因此,确定此分离菌为多杀性巴氏杆菌。与参考序列AF016259比对,在第390位上;本研究结果多了1个 T,在401位上少了1个C,总数仍为457个碱基。

图4 分离株 KMT-1基因序列及比对结果Tab.4 The result of analysis K MT-1 gene sequence of Pasteurellosis multocida

3 讨论

1)根据流行病学、临床症状、病理变化和实验室诊断,确诊为多杀性巴氏杆菌。由于巴氏杆菌为条件性致病菌,且该病多因冬春两季气温骤变、潮湿、营养缺乏等诱因导致机体抵抗力下降,病原菌侵入机体,经淋巴循环,而发生内源性感染。及早发现本病,结合药敏试验,可以较好的治愈。平时要加强饲养管理,避免牲畜受寒、拥挤,保持牛场清洁卫生,定期杀虫灭鼠,作好平时的预防消毒工作。

2)在致病性试验中小白鼠100%的死亡。因此,在防治过程中除了及时的预防,还要辅助治疗以尽量挽回损失。根据药敏试验的结果来看,其对庆大霉素、链霉素、四环素、土霉素、磺胺等药物敏感。由于牦牛饲养为野生放牧,其用药量很少,本次分离的菌耐药性较低,药物治疗可起到很好的效果。

3)在本实验多杀性巴氏杆菌生化的鉴定结果中发现,临床分离株鉴定结果与标准菌并不完全一致。生化试验的不稳定性和生化项目选择不全,会导致不准确性的判定结果。因此,PCR鉴定是非常理想辅助鉴定手段,本实验中参考的多杀性巴氏杆菌保守 KM T-1基因(GenBank登录号:AF016259)合成的引物具有很强的特异性[9]。对葡萄球菌、白色念珠菌、链球菌及大肠杆菌和常见上呼吸道革兰氏阴性菌均不能扩增出特异性条带。

4)在实验中牦牛多杀性巴氏杆菌 KM T-1基因序列扩增片段大小与 Kirsty M等[9]报道的原始序列大小一致,为 457bp(GenBank登录号:AF016259),但牦牛多杀性巴氏杆菌 KM T-1基因序列与 GenBank中提交序列均有缺失、增加和突变碱基(图4),从而导致蛋白序列的变化,这可能是不同地域、不同菌株之间的差异。根据DNAStar分析部分变化的蛋白存在于预测的抗原表位上,但是否能引起抗原性的变化,还待进一步研究。

[1]陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社,2001.

[2]吴范庚,钱心元.我国多杀性巴氏杆菌耐热抗原血[J].中国兽医杂志,1987,13(12):2-4.

[3]蔡宝祥.动物传染病诊断学[M].南京:江苏科学技术出版社,1993.

[4]陈薄言.兽医传染病学[M].北京:中国农业出版社,2007.

[5]郝士海.现代细菌学培养基和生化试验手册[M].北京:中国科学技术出版社,1992.

[6]Townsend K M,Frost A J,Lee C W,et al.Development of PCR assays for species and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates[J].Journal of Clinical Microbiology,1998,36(4):1096-1100.

[7]刘进元,常智杰,赵广荣.分子生物学实验指导[M].北京:清华大学出版社,2002.

[8]唐先春,吴斌,索绪峰,等.猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[J].畜牧兽医学报,2005,36(6),590-595.

[9]Kirsty M T ownsend,John D Boyce,Jing Y Chung,et al.Genetic organization ofPasteurella multocidacap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J].Journal of Clinical Microbiology,2001,39(3):924-929.

Isolation Identification and Sensitive Test of Drug ofPasteurellosis multocidafrom Yak in Xinjiang

KANG Lichao1,TIAN Liang2,ZHANG Xiaoyu2,WANG Pingfu3,BO Xinwen1,MA Xun2
(1 Key Lab of Sheep Reproduction Biotechnology,Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation,Shihezi 832000,China;2 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;3 The Agriculture Division 12 of the Xinjiang Production and Construction Corps,Urumqi 830009,China)

S858.23

A

1007-7383(2010)04-0436-05

2009-08-25

2008年国家大学生创新性实验计划

康立超(1980-),男,助理研究员,从事动物传染病的诊断与防治研究;e-mail:klc003@163.com。