利用微卫星标记分析巢湖鸭群体的遗传多样性

赵东伟,汤青萍,李慧芳,陈宽维,陈荣久,马月辉

(1中国农业科学院家禽研究所,扬州225003;2安徽庐江县农业开发委员会,庐江100094;3中国农业科学院畜牧研究所,北京100094)

利用微卫星标记分析巢湖鸭群体的遗传多样性

赵东伟1,汤青萍1,李慧芳1,陈宽维1,陈荣久2,马月辉3

(1中国农业科学院家禽研究所,扬州225003;2安徽庐江县农业开发委员会,庐江100094;3中国农业科学院畜牧研究所,北京100094)

巢湖鸭是我国著名中型蛋肉兼用品种,为了进一步阐明其保种及群体遗传结构状况,通过资源调查摸清了巢湖鸭的外貌特征、生产特性和适宜分布的生态环境,采用26个多态性较好的微卫星标记,检测了巢湖鸭的遗传多样性。结果表明:26个微卫星位点均表现出多态性,总共检测到111个等位基因,平均等位基因数为4.269个;群体多态信息含量为0.526,杂合度为0.610。瓶颈效应分析结果表明:该群体已偏离了突变-漂移平衡,近期可能经历了瓶颈效应,种群数量曾经下降。根据调查结果及遗传多样性检测数据,提出通过原产地保护,从而保护巢湖鸭的建议。

巢湖鸭;微卫星;遗传多样性;保种

Abstract:The Chaohu duck is a famous egg-meat breed with medium-body type in China.Genetic diversity of 26 microsatellite markers were analyzed,Allele frequency,genotypic frequency,heterozygosity,polymorphism information content(PIC)and F-statistics were calculated.The results showed that a total of 111 alleles were distinguished.All the microsatellites were polymorphic,with mean allelic number of 4.269,ranging 2～11 per locus.The expected hererozygosity in the population ranged between 0.096 and 0.849,with a mean of 0.610,indicating considerable genetic variation in this population.Bottleneck analysis indicated that heterozygosis was obvious and group was not in the balance between mutation and excursion for its bottleneck.We suggest that the moderate level of genetic diversity retained in Chaohu populations has the potential to supply sufficient genetic diversity for the species conservation through the recruitment of Chaohu resources in the region.

Key words:Chaohu duck;microsatellite;genetic diversity;conversation

我国拥有丰富的水禽品种资源,主要分布在长江流域以及以南地区的沪、苏、浙、赣、皖、闽、粤、桂、川、两湖等11省区。20世纪80年代以来,我国先后培育出了一些生产性能较高的品种(系),水禽业特别是养鸭业有了较大规模的发展,从国外引进了一些生产性能优良的鸭品种,但同时也对我国固有鸭品种资源的保存与利用也带来了危机[1]。合理利用和保护我国丰富的家鸭品种资源,提高家鸭育种水平,培育优质高产的家鸭新品种,是养鸭业可持续发展的重要组成部分。巢湖鸭作为我国的著名中型蛋肉兼用品种,屠宰率较高,而且以肉嫩味美著称。

种群大小的变化,如种群扩增或经历瓶颈效应后,将会导致种群遗传结构的改变,如果忽略这些过程,会使我们对种群现在的遗传结构和种群进化过程产生错误的理解[2]。巢湖鸭群体在近期是否经历种群大小的变化,经历这种后的遗传多样性及遗传结构如何,如何制定合适的保种措施对巢湖鸭进行保护与管理,是目前受关注的问题。

随着分子生物学技术的发展,许多分子标记被应用于种群遗传的研究,并有效解决了保护遗传学中的许多问题。其中微卫星DNA(microsatellite DNA)因具有多态性高、共显性遗传、选择中性、易于检测、重复性好、可以提供高分辨率的遗传信息等特点,不仅应用于个体水平上的研究(包括个体识别、交配系统和亲子分析),而且在种群水平研究上(如种群遗传结构分析、基因流、有效种群大小估计及种群的系统地理发生分析等方面)倍受关注。

本研究在国内首次借助微卫星DNA标记从分子水平对巢湖鸭品种资源的遗传多样性、遗传结构和遗传瓶颈效应进行了研究,以期为今后制定有效的保种措施保护巢湖鸭提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

巢湖鸭采自安徽庐江县。采样设计的公母之比为1∶4,其中,公鸭 12只,母鸭 48只,符合Barker等[3]关于评估遗传多样性抽样公式和样本含量的要求。血液基因组DNA的提取参照文献[4]并稍加改进。

1.2 方法

1.2.1 资源调查方法

资源调查根据文献[5]中的方法进行,重点对禽种的品种特征、生产性能、保种数量、开发利用的变化情况以及目前保种的方法、取得的成果等信息逐一进行原产地现场调查。

1.2.2 微卫星位点及PCR条件

根据 GenBank和文献上提供的26对微卫星引物作为实验位点[6-8]。实验所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司(Sangon)合成。微卫星 引 物 包 括:APL2、APL11、APL12、APL26、APL36、APL83、APL82、APL81、APL80、APL79、APL78、 APL77、 CMO12、 CMO11、 APH01、APH07、APH09、APH10、APH11、SMO6、SMO7、SMO9、SMO10、SMO11、SMO12、SMO13。

常规PCR,25μL扩增体系,8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,电泳结束后用硝酸银染色。

1.2.3 数据分析

利用Microsatellite-Toolkit软件[9]计算等位基因频率、观察杂合度与期望杂合度。根据 FSTAT程序计算每个微卫星座位的群体内遗传分化系数FIS,由Benferroni程序计算 FIS的显著性。并根据公式计算各鸭品种中的多态信息含量(polymorplism information content,PIC)。

用2种不同的方法来检测巢湖鸭近期是否经历遗传瓶颈效应。一种是根据各位点的等位基因频率,基于无限等位基因模型(the infinite allele,IAM)、逐步突变模型(stepwise mutation,SMM)和双相突变模型(two phased,TPM),通过符号检验(sign test)、标准化差异检验(standardized differences test)和 Wilcoxon符号秩次检验(wilcoxon sign-rank test)分析杂合过度是否显著;另一种方法是Cornuet等[10]采用的模式迁移的图形表示法。这2种方法均由Bottleneck v1.2.02分析软件(http://www.ensam.inra.fr/URLB)分析得出[11]。

2 结果与分析

2.1 生态环境和外貌特征

2.1.1 生态环境

巢湖鸭主产地为安徽省中部、巢湖周围的庐江、巢县、肥东、肥西、舒城、无为、和县、含山等县。主产区位于江淮分水岭以南、大别山以东、长江北岸以巢湖为中心的低洼湖沼冲积平原,境内圩田棋布,河渠纵横,湖泊塘坝繁多,水面20万hm2,占该地区总面积的20%左右。该地区气候温和,水量充沛,土地肥沃。年平均气温为16℃,无霜期为240 d,成年降水量为966 mm。该地区为长江流域水稻主产区之一,素称“安徽粮仓”。丰富的水生动植物饲料资源和大面积水田及收获时的遗谷,为放牧养鸭提供了充足而廉价的饲料。

2.1.2 外貌特征

巢湖鸭体型中等大小,匀称紧凑,颈细长,体躯长方,羽毛紧密。公鸭头颈上部墨绿色带有光泽,前胸和背腰褐色带黑色条斑,腹部白色,臀部黑色,称为“绿头粉裆”;喙黄绿;虹彩褐色;胫、蹼橘红色,爪黑色。母鸭全身羽毛浅褐色带黑色细花纹,称浅麻细花;眼上方有白或淡黄眉纹;翅膀有蓝绿色镜羽;喙有黄、黄绿、黄褐等色;虹彩褐色;胫、蹼橘红色,爪黑色。

2.1.3 生产特性

该区农民历来从事棚鸭饲养,以放牧为主、补饲为辅的养鸭方式,使该品种具有体质健壮、行动敏捷、抗逆性和觅食能力强的特点。成年公鸭体重2420 g左右,母鸭体重2130 g;270日龄屠宰率:半净膛 ,公 83.8%,母 84.4%;全净膛 ,公 72.6%,母73.4%。开产日龄150 d,产蛋以白色居多,青色较少,年产蛋160～180枚,蛋重70 g/枚。

2.1.4 保护状况

根据2002年最新资源调查,巢湖鸭现采用保种区保护,在保种区内存栏200万只左右,属正常保种状态[12],开发利用情况较好。

2.2 群体及各微卫星位点的遗传参数

由表1可见,26个微卫星位点均表现出多态性,总共检测到111个等位基因。

单个座位的等位基因数从2到11不等,等位基因数最多的位点为APL2(11个),平均数4.269个。

CM011座位的期望杂合度和 PIC值最低,为0.096和0.090;而APL2座位则拥有最高的期望杂合度和 PIC值,为0.849和0.822;平均多态信息含量为0.526,平均杂合度为0.610。

群体内遗传分化系数FIS从-1.000到1.000不等,有21个座位表现为杂合子剩余,5个座位表现为杂合子缺失,从总体来看,巢湖鸭表现出了显著的杂合子剩余状态(FIS=-0.461,P<0.01)。

表1 巢湖鸭在26个微卫星位点的遗传参数Tab.1 Genetic paramters of 26 microsatellite loci in Chaohu duck

2.3 瓶颈效应

基于IAM、TPM和SMM的假设,得到巢湖鸭在3种突变模型下期望杂合度 HEQ。3种检验方法下 P值均达到极显著水平,说明巢湖鸭群体在近期经历了瓶颈效应,这点也可以从模式迁移图看出,本研究所得的图1并不符合标准的L-型分布。

表2 杂合子剩余或缺失的位点数以及3个模型分析瓶颈效应的 P值Tab.2 Number of loci showing heterozygosity excess or deficiencyin and P value of bottleneck effect under 3 mutation models of IAM,TPM and SMM

图1 巢湖鸭遗传瓶颈效应分析的模式迁移Fig.1 The migration mode of bottleneck effect in Chaohu duck

3 讨论

3.1 品种的遗传多样性

1)多态信息含量是衡量片段多态性的较好指标。Botstein等[13]首先提出了用多态信息含量指标衡量基因变异程度的高低:当 PIC>0.5时,该位点为高度多态位点;0.25

本研究结果表明,所选26个微卫星中的13个为高度多态,12个为中度多态,1个为低度多态。群体在26个微卫星座位中19个符合H-W平衡,说明本次所选用的为卫星标记可作为有效的遗传标记用于遗传多样性分析,同时也说明本次试验所抽取的样本及数目能够反映群体的实际情况。

2)遗传杂合度又称基因多样度,反映各群体在n个位点上的遗传变异。一般认为它是度量群体遗传变异的1个最适参数。

本研究结果表明:巢湖鸭的杂合度为0.610遗传多样性相对较高,选择的潜力相对较大,在保持原有品种特征的前提下可做必要的品种纯合选育。

3.2 保种与选育的探讨

1)当群体有较大的减少时,会导致等位基因的丢失和群体杂合度的过量或缺失,这一现象被称为瓶颈效应。群体在经历遗传瓶颈的过程中,等位基因多样性减少较杂合度减少要快,而且这一作用将保持数代直至群体再次回到遗传平衡状态,因此可以用杂合度过量对群体是否经历瓶颈效应进行检测;另外,某一位点上等位基因数目对群体大小的波动也较敏感,也可以作为瓶颈效应检测的一种标志。

本研究的瓶颈效应分析结果表明,巢湖鸭在近期经历过瓶颈效应。处于突变-漂移平衡下的种群,微卫星位点显示杂合过剩与杂合不足的概率应大致相等。

2)种群在进化中经历瓶颈效应后,等位基因和基因多样性(杂合度)均会降低,其中等位基因丢失比杂合度降低速度快,从而导致杂合过剩。因此,通过杂合度是否过剩分析可以判断种群数量是否下降。对一个种群是否具有显著数量的杂合过剩的位点,常用此方法来进行检验,即符号检验、标准差检验和Wilcoxon符号秩次检验。

本研究用3种方法检验均得到了同样的结果,P值均达到极显著水平,这表明巢湖鸭在近期经历过瓶颈效应,种群数量曾经下降,故需要采取措施来对巢湖鸭进行保护和管理。

3)巢湖鸭在原产地并未受到高强度的选择,在实际中基本以本品种利用为主,受到外来鸭种的影响较小。巢湖鸭品种资源的遗传多样性较丰富,在作好保种工作的同时,可向不同方向选育专门化的品系,加强这些品种的开发力度,以满足商业生产的需求。实现以品种的开发利用来支持种质资源的保存,既保了种又充分发挥了品种资源的经济优势,这必将促进鸭业的发展。

据清乾隆年间就有生产的著名佳肴“无为熏鸭”的历史推断,巢湖鸭的形成已有200年以上的历史。保护利用好这一古老的地方鸭种,是广大畜牧工作者的责任。物种的保护既要考虑其生存的生态系统,又要考虑品种内遗传多样性的完整性,水禽的保护尤其要注意这一点。

[1]齐景发,贾幼陵,何新天,等.中国畜禽遗传资源状况[M].北京:中国农业出版社,2004,16.

[2]Estoup A,Angers B.Microsatellites and minisatellites for molecular ecology:theoretical and empirical considerations[C].Carvalho G R.Advances in moleculae ecology,Press,Amsterdam:Nato Sciences Series IOS,1998:55-86.

[3]Barker P S F.A global protocol for determining genetic distance among domestic livestock breeds[J].Proceeding of 5th World Congress on Genetic Application of Livestock Production,1994,21:501-508.

[4]萨姆布鲁克,弗里奇,曼尼阿帝斯.分子克隆实验指南[M].2版.北京:科学出版社,2002.

[5]陈伟生.畜禽遗传资源调查技术手册[M].北京:中国农业出版社,2005.

[6]Weber J L.Infomativeness of human(dC-dA)n·(dG-dT)n polymorphisms[J].Genomics,1990,7:524-530.

[7]Maak S,Neumann K,Von Lengerken G,et al.First seven microsatellites developed for the Peking duck(Anas platyrhynchos)[J].Anim Genet,2000,31(3):233.

[8]Paulus B K,Tiedemann R.T en polymorphic autosomal microsatellite loci for the Eider duck Somateria mollissima and their cross-species applicability among waterfowlspecies(Anatidae)[J].Molecular Ecology,2003,3:250-252.

[9]Park S D E.Trypanotolerance in west African cattle and the population genetic effects of selection[D].Dublin:University of Dublin,2001.

[10]Cornuet J M,Luikart G.Description and power analysis of two tests for detecting recent population bottlenecks from allele frequency data[J].Genetics,1996,144,2001-2014.

[11]Piry S,Luikart G,Cornuet J M.Bottleneck:a computer program for detecting recent reductions in the effective population size using allele frequency data[J].J Hered,1999,90,502-503.

[12]FAO.FAO Programmes for the preservation of animal genetic resources-a report of the expert consultation[R].Rome:FAO,1989.

[13]Botstein D,WhiteR L,Skolnick M,et al.Construction of a genetic linkage map in man using restrictionfragment length polymorphisms[J].AmJ Hum Genet,1980,32:314-331.

An Analysis of the Genetic Diversity of the Chaohu Duck by Using Microsatellite Markers

ZHAO Dongwei1,TANG Qingping1,LI Huifang1,CHEN Kuanwei1,CHEN Rongjiu2,MA Yuehui3
(1 Institute of Poultry Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Yangzhou 225003,China;2 Committee of Agricultural Development of Lujiang County,Anhui Province,Lujiang 100094,China;3 Institute of Animal Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100094,China)

S188

A

1007-7383(2010)04-0427-05

2009-05-06

国家科技支撑计划项目(2008BADB2B08),江苏省科技服务平台项目(BM2008170)

赵东伟(1972-),男,助理研究员,从事家禽遗传资源及育种研究;e-mail:yzzdw0316@163.com。

陈宽维(1955-),男,研究员,从事家禽遗传育种与家禽资源保护研究;e-mail:ckw0079@163.com。