白背毛木耳菌丝体深层发酵工艺优化

冀 宏，李 智，郑丽雪

(常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500)

白背毛木耳菌丝体深层发酵工艺优化

冀 宏，李 智，郑丽雪

(常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500)

以菌丝体干质量浓度为考察指标，对白背毛木耳液体深层发酵的培养基及工艺条件进行优化。通过正交试验(L9(34))确定了发酵培养基最佳配方。在此基础上，基于三因素三水平的Box-Behnken设计试验，采用响应曲面分析法对影响白背毛木耳菌丝体生长的发酵温度、摇瓶转速和发酵时间进行优化，确定最佳的培养条件。结果表明白背毛木耳深层发酵的最佳培养基组分为：葡萄糖2.00g/100mL、酵母膏0.20g/100mL、磷酸二氢钾0.25g/100mL、硫酸镁0.15g/100mL，当发酵温度为26℃、转速为182r/min、发酵时间为6.07d(145.7h)时发酵菌丝体干质量浓度最高，可达1.93g/100mL，较优化前提高了1.24倍。

白背毛木耳；深层发酵；菌丝体干质量；正交试验；响应曲面法

白背毛木耳(Auricularia polytricha) 隶属于担子菌亚门，层菌纲，木耳目，木耳科，木耳属中的毛木耳种[1]。按照背部绒毛层颜色不同，毛木耳分为白背毛木耳和黄背毛木耳两个商业化栽培品种[2]。白背毛木耳于20世纪末由台湾省引进，是国际市场需求的主要毛木耳品种。

食用菌深层发酵具有时间短、效率高、成本低等优势[3-4]。对毛木耳深层液体发酵技术的研究及其发酵产物的开发利用具有很大的潜力，展现出诱人的应用前景：1)利用液态深层发酵菌丝体生产毛木耳多糖，药理研究表明[5-9]毛木耳多糖具有凝血、抗衰老、抗血栓、降血脂、免疫增强和抗肿瘤等作用；2)生产毛木耳液体菌种，实践证明液体菌种具有生产周期短、菌龄一致、菌丝发育点多、萌发快、成本低等优点[3,10-11]；3)利用深层发酵产物开发功能性食品、营养饮品和保健品[12]。

目前，国内外关于毛木耳深层发酵技术的研究报道很少。Jonathan等[13]研究了野生采集毛木耳菌株在液体培养基中的生长条件；Xu等[14]采用均匀设计和回归分析的方法对毛木耳深层发酵条件进行了优化。国内的一些研究主要是集中在毛木耳深层发酵菌丝体的营养成分研究、液体菌种的应用研究及发酵条件研究方面[1,10,15-16]，暴增海等[16]报道了关于黄背毛木耳的液体发酵培养优化，而针对白背毛木耳深层发酵技术的系统研究尚未见报道。本实验拟以白背毛木耳发酵菌丝体干质量(生物量)为目标产物，采用正交试验和响应面分析法分别对发酵培养基组分和发酵条件进行优化，以期为白背毛木耳深层发酵技术规模应用和发酵食品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

白背毛木耳采自江苏省泗洪产区子实体，经PDA培养基组织分离、纯培养，保藏。

1.1.2 种子发酵培养基

玉米粉1g/100mL、豆粕1g/100mL、葡萄糖2g/100mL、牛肉膏0.5g/100mL、磷酸二氢钾0.1g/100mL、硫酸镁0.1g/100mL、VB10.01g/100mL，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 菌丝体干质量测定

将发酵醪液过80目不锈钢标准筛，用蒸馏水冲洗3次，将过滤所得的菌丝体于60℃电热培养箱中烘干至质量恒定，用电子天平称质量，得菌丝体细胞干质量。

1.2.2 摇瓶发酵

将白背毛木耳液体菌丝体接种到发酵培养基中，接种量为10%，置于25℃，180r/min的恒温摇床上振荡培养6 d。

1.2.3 发酵培养基单因素试验

1.2.3.1 碳源的选择

考察葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉6种碳源对发酵产菌丝体的影响，确定出最佳碳源。培养基组成为：蛋白胨0.15g/100mL、磷酸二氢钾0.3g/100mL、硫酸镁0.15g/100mL、碳源2g/100mL、pH值自然。之后对筛选出的最佳碳源进行浓度添加试验，以确定最佳水平范围。

1.2.3.2 氮源的选择

考察牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出汁、玉米粉、麸皮、豆粕6种氮源对发酵产菌丝体的影响，确定最佳氮源。培养基组成为：葡萄糖2g/100mL、磷酸二氢钾0.3g/100mL、硫酸镁0.15g/100mL、氮源0.15g/100mL，pH值自然。之后对筛选出的最佳氮源进行浓度添加试验，以确定最佳水平范围。

1.2.3.3 无机盐的选择

分别考察KH2PO4、MgSO4两种无机盐的添加量对发酵产菌丝体的影响。KH2PO4添加量为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35g/100mL。MgSO4添加量为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3g/100mL。

1.2.4 发酵条件单因素试验

1.2.4.1 发酵温度

摇床转速180r/min，发酵时间为6d条件下分别考察22、24、26、28、30、32℃不同发酵温度对发酵产菌丝体的影响，确定最佳发酵温度。

1.2.4.2 摇床转速

在发酵温度25℃，发酵时间为6d条件下，分别考察120、140、160、180、200、220r/min转速条件下对发酵产菌丝体的影响，确定最佳摇床转速。

1.2.4.3 发酵时间

在温度25℃、摇床转速180r/min条件下，发酵开始后每隔24h测定菌丝体干质量和发酵液pH值，确定最佳发酵时间。

1.2.5 发酵条件Box-Behnken中心组合试验设计及响应面分析[17-18]

采用Box-Behnken中心组合试验设计，进一步进行三因素三水平的响应面分析实验。确定最佳的发酵条件。编码与因素对应关系如表1所示。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基单因素试验结果

2.1.1 碳源对发酵产菌丝体的影响

图1 碳源对白背毛木耳菌丝体深层发酵的影响Fig.1 Effect of carbon source on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

由图1可见，发酵培养基最佳碳源为葡萄糖，菌丝体干质量浓度可达1.45g/100mL。其次为可溶性淀粉，果糖对菌丝体生长作用最小，菌丝体干质量浓度仅为0.32g/100mL。由图2可见，葡萄糖质量浓度为2g/100mL时，菌丝体干质量浓度达最大值，为1.53g/100mL。

图2 葡萄糖质量浓度对白背毛木耳菌丝体深层发酵的影响Fig.2 Effect of glucose concentration on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

2.1.2 氮源对发酵产菌丝体的影响

图3 氮源对白背毛木耳菌丝体深层发酵的影响Fig.3 Effect of nitrogen source on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

图4 酵母浸出汁质量浓度对白背毛木耳菌丝体深层发酵的影响Fig.4 Effect of yeast extract concentration on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

由图3可见，最佳氮源为酵母浸出汁，菌丝体干质量浓度达到1.61g/100mL，其次为蛋白胨，麸皮对菌丝体生长作用最小。可能是酵母浸出汁中丰富的生长因子促进了白背毛木耳菌丝体的生长。由图4可知，当酵母浸出汁质量浓度为0.3g/mL时，菌丝体干质量浓度达1.67g/100mL。

2.1.3 无机盐对发酵产菌丝体的影响

图5 无机盐质量浓度对白背毛木耳菌丝体深层发酵的影响Fig.5 Effect of inorganic salt concentration on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

由图5可见，KH2PO4最佳质量浓度为0.2g/100mL，MgSO4最佳质量浓度为0.1g/100mL。

2.2 发酵培养基正交试验优化

基于发酵培养基单因素试验结果，进行L9(34)正交试验设计，以菌丝体干质量浓度为指标，正交试验结果及分析见表2，方差分析见表3。

表2 L9(34)正交试验结果与极差分析Table 2 Results and range analysis of orthogonal experiments

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments

表2直观反映，第4号试验组A2B1C2D3的菌丝体干质量浓度最大(1.86g/100mL)，是各试验组中效果最好的；极差分析显示，影响菌丝体发酵的因素主次顺序为：A＞D＞C＞B。理论最优条件组合为A2B3C3D3，即发酵培养基中葡萄糖、酵母浸出汁、磷酸二氢钾和硫酸镁质量浓度分别为2.0、0.4、0.25g/100mL和0.15g/100mL时，发酵产白背毛木耳菌丝体干质量浓度最高。然而方差分析表明，每一个因素对菌丝体干质量浓度都无显著性影响(表3)，加之酵母浸出汁为最次要影响因素，考虑到实际生产过程中降低成本的需要，酵母浸出汁的质量浓度可选取水平1，即0.2g/100mL，从而形成新的组合方案，即A2B1C3D3。对此进行验证实验，结果表明，在相同工艺条件下得发酵菌丝体干质量浓度1.91g/100mL，高于A2B1C2D3条件下菌丝体干质量浓度1.86g/100mL，故发酵培养基优化方案确定为A2B1C3D3。

2.3 发酵条件单因素试验

图6 温度对发酵产菌丝体的影响Fig.6 Effect of fermentation temperature on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

由图6可见，温度从22℃上升到26℃，菌丝体干质量浓度逐渐升高，增加趋势明显，高于26℃时，菌丝体干质量浓度迅速下降，故发酵温度以26℃为适宜。

图7 摇床转速对发酵产菌丝体的影响Fig.7 Effect of rotation speed on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

由图7可见，当摇床转速为180r/min时，菌丝体干质量浓度最高，转速过高或过低均不利于白背毛木耳菌丝体的生长。

图8 发酵时间对发酵产菌丝体的影响及发酵过程pH值变化Fig.8 Effect of fermentation time on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha and pH change during fermentation

由图8可见，发酵前6d，随着发酵时间延长，菌丝体干质量浓度呈快速上升趋势，发酵液的pH值呈现逐渐下降趋势；6d之后菌丝体干质量浓度缓慢上升直至基本稳定，同时，发酵液pH值下降趋缓至基本稳定，考虑到成本因素，将发酵时间确定为6d(144h)。

2.4 响应面试验结果与优化分析

2.4.1 Box-Benhnken中心组合试验设计及响应面分析采用Box-Benhnken试验设计对白背毛木耳菌丝体发酵条件进行三因素三水平响应面分析试验，包括12个析因试验和3个中心试验。并运用SAS软件的RSREG(Response surface regression)程序对15个试验点的响应值进行回归分析。经回归拟合后，确定函数表达式，结果见表4。

表4 Box-Behnken中心组合试验设计及结果Table 4 Design of Box-Benhnken central composite experiments and biomass of mycelia

采用SAS RSREG程序对表5进行分析，可知各因素影响程度主次顺序为：X1>X2>X3；X1、X2、X3、项对菌丝体干质量浓度影响极为显著，X1X2项影响显著，X1X3、X2X3项影响不显著。

表5 响应曲面分析试验二次回归模型参数Table 5 Quadratic regression model parameters of response surface analysis experiments

运用SAS程序进行回归拟合删除不显著项，简化后的回归方程如下：

对该方程的显著性分析得F1=40.36，相应的概率值为0.0004；失拟项检验分析得F2=2.21，P=0.3261，R2=0.9864。表明方程的模型达到极其显著；失拟性分析显示该回归方程无失拟因素存在，回归模型与实测值能较好地拟合。当发酵温度、摇床转速和发酵时间分别为：26.118831℃、182.147041r/min、6.071156d(即145.7h)时，得到的菌丝体干质量浓度理论预测最大值为1.965585g/100mL(表 6)。

表6 响应曲面分析试验优化值及在最优条件下的菌丝体干质量浓度Table 6 Optimal values of response surface experiments and mycelium biomass under the optimal conditions

2.4.2 响应面直观分析

为观察某两个因素对发酵产菌丝体的交互影响，还需进行降维分析[17]。根据回归方程所做的响应曲面图及其等高线图(图9～11)即可对任何两因素交互影响效应进行分析与评价，并从中确定最佳因素水平范围。从响应面的最高点和等值线可以看出，在所选的范围内存在极值，既是响应面的最高点，同时也是等值线最小椭圆的中心点。

图9 温度和摇床转速对发酵产菌丝体交互效应的响应面及其等高线图Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between fermentation temperature and rotation speed on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

图9显示，当发酵时间位于中心水平(即X3为6d)时，摇床转速轴向等高线变化密集，而培养温度轴向等高线的变化相对稀疏，故培养温度对响应值峰值的影响较摇床转速影响大，发酵温度和摇床转速的交互作用较强。在摇床转速为160.5～204r/min，培养温度在24.5～27.5℃的范围内，发酵液所能获得的最大菌丝体干质量浓度为1.719g/100mL。

图10 温度和发酵时间对发酵产菌丝体交互效应的响应面及其等高线图Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between fermentation temperature and fermentation time on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

图10显示，当摇床转速位于中心水平(即X2为180r/min)时，发酵温度和发酵时间的轴向等高线疏密程度相似，故两者间的交互作用不大。发酵时间为5.1～7.2d，温度为24.5～27.5℃范围内，发酵液所能获得的最大菌丝体干质量浓度为1.63g/100mL。

图11 摇床转速和发酵时间对发酵产菌丝体交互效应的响应面及其等高线图Fig.11 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between rotation speed and fermentation time on submergedfermentation of mycelia from Auricularia polytricha

图11显示，当培养温度位于中心水平(即X1为26℃)时，摇床转速和发酵时间的交互作用也不大。在发酵温度25～27.5℃、发酵时间5.1～7.2d的最佳条件下，发酵液所能获得的最大菌丝体干质量为1.823g/100mL。

2.4.3 验证实验

为了检验响应曲面法结果的可靠性，对分析得到的白背毛木耳深层发酵优化条件：培养温度26℃、摇床转速182r/min、发酵时间6.07d(即145.7h)进行验证实验，3次实验结果发酵菌丝体干质量平均值为1.93g/100mL，与预测值误差为±1.82%，说明模型与预测值拟合较好，回归方程为白背毛木耳深层发酵工艺提供了一个合适的模型。

3 结论与讨论

3.1 通过正交试验、Box-Behnken试验设计及响应面分析，实现了白背毛木耳菌丝体深层发酵工艺的优化。确定的最佳发酵培养基组分为：葡萄糖2.00g/100mL、酵母浸出汁0.20g/100mL、磷酸二氢钾0.25g/100mL、硫酸镁0.15g/100mL；优化发酵条件为：温度26℃、摇床转速182r/min、发酵时间6.07d(145.7h)。此条件下发酵菌丝体干质量浓度可达到1.93g/100mL，比优化前的产量提高了1.24倍。

3.2 用响应面分析研究的因素一般为2～3个，而对于3个以上的研究结果比较复杂[18]，所以对于培养基的优化选用L9(34)的正交试验。响应面分析求得的回归方程精度高，能研究几种因素的交互作用的回归分析，所以本实验对于发酵条件的优化选用了响应面分析方法。结果表明，响应面分析法不仅规模小，而且效果显著，而正交试验则更具可比性与直观性。二者结合进行发酵工艺优化研究在降低实验成本的同时，提高了实验效率。

3.3 对于复杂的发酵代谢过程而言，发酵效果可以体现在生物量的增多和有效代谢产物的生成两个方面[19]。所以，当采用不同的考察指标时，工艺优化的结论可能是不同的。由于本实验选择发酵生物量作为惟一的指标，研究结论仅是在此指标下的优化结果，而针对某一具体代谢产物如多糖的产生却不一定条件最优，需要在今后的实验中作进一步探讨。

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Optimization of Submerged-fermentation Processing of Mycelia fromAuricularia polytricha

JI Hong，LI Zhi，ZHENG Li-xue
(College of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

Biomass (dry weight) of mycelia was used as index to explore the optimal culture medium and processing conditions of submerged-fermentation of mycelia fromAuricularia polytricha. The optimal fermentation broth formula was investigated by Box-Behnken and response surface analysis to be 2.00 g glucose, 0.20 g yeast extract, 0.25 g KH2PO4, and 0.15 g MgSO4 in 100 mL of culture medium. The optimal fermentation conditions were fermentation temperature of 26 ℃, rotation speed of 182 r/min and fermentation time of 145.7 h. Under the optimal culture medium and fermentation conditions, the dry mycelia was up to 1.93 g in 100 mL of culture medium, which was increased by 1.24 fold compared with the conditions before optimization.

Auricularia polytricha；submerged-fermentation；biomass (dry weight) of mycelia；orthogonal experiment；response surface methodology

Q814.3

A

1002-6630(2010)23-0204-06

2010-08-20

2009年江苏省科技厅苏北科技专项资助项目(BN2009320)；苏州市科技发展计划项目(SZS201007)

冀宏(1969—)，男，研究员，博士研究生，研究方向为食、药用菌工程技术研究及现代农业技术经济与管理。E-mail：jihong8848@126.com