高效溴氨酸脱色菌的分离鉴定及其特性研究

周元祥, 石倩倩, 叶红曼

(合肥工业大学资源与环境工程学院,安徽合肥 230009)

溴氨酸是一种重要的蒽醌染料中间体,其生产废水具有高色度、高COD及高盐度的特点,传统的生物法难以处理,废水中的溴氨酸成分由于具有稳定的稠环芳香烃结构和较高的水溶性而长期滞留于环境中[1]。生物法脱色以其费用低、环境友好而受到了人们的重视[2]。研究表明,利用微生物处理溴氨酸废水是一项可行的途径[3-7]。微生物具有繁殖速度快、适应性强等特点,利用高效脱色微生物进行环境污染治理不仅成本低,且可减少二次污染,因此被认为是染料脱色和降解最经济有效的方法[8],分离高效、多样的微生物菌株成为进一步开展工作的基础。

本实验从污泥中分离筛选出1株高效脱色菌株,考察了碳源、氮源、磷酸盐等不同的培养基成分对菌株脱色能力的影响,并初步探讨了培养条件如温度、pH值、溴氨酸初始质量浓度、接种量及盐度对溴氨酸脱色的影响,以期为该菌株在溴氨酸生产废水处理中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种与染料

菌种筛选自实验室处理溴氨酸废水的ABR反应器污泥。染料为溴氨酸(Bromamin acid),购自南京恒信达化工有限公司。其化学名称为1-氨基-4-溴蒽醌-2-磺酸,性状为红色针状晶体,溶于水;最大吸收波长482 nm;结构式略。

1.2 培养基

(1)牛肉膏蛋白胨培养基。牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,蒸馏水 1000 mL,pH值为7.2(固体培养基加20 g琼脂)。

(2)分离纯化培养基。牛肉膏蛋白胨固体培养基中加入染料,所得培养基中染料质量浓度为200 mg/L。

(3)液体脱色培养基。C6H12O61.5 g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 1 g,KH2PO42.65 g,Na2HPO4◦12H2O 4.26 g,MgSO4◦7H2O 0.2 g,FeSO4◦7H2O 0.01 g,CaCl20.02 g,MnSO4◦7H2O 0.002 g,染 料 0.2 g,蒸 馏水1000 mL,pH值为7.2。

1.3 实验仪器

所用仪器如下:754PC型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)、HZQ-F160A型高低温恒温振荡培养箱(上海一恒科技有限公司)、高压蒸汽灭菌器、光学显微镜、精密pH计、高速离心机、快速混匀器、冰箱及洁净工作台等。

1.4 溴氨酸脱色菌的分离筛选

取ABR反应器中污泥制成污泥悬浮液,经梯度稀释后,涂布于分离纯化培养基平板上,30℃培养2 d。挑取有脱色圈且菌落明显的菌株进行反复划线分离,获得纯菌株,保存在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上。对分离出的纯菌株进行脱色能力考察,筛选出对染料具有较好脱色作用的菌株。

1.5 单一菌株的脱色能力考察

将纯化后菌株接入液体脱色培养基中(染料质量浓度100 mg/L,每株菌株接3管作对照),30℃静止培养48 h后,以6 000 r/min的转速离心30 min除菌体,缓缓倾倒出上清液。以未加染料的培养基为参比,测量上清液在485 nm处(溴氨酸最大吸收峰波长为485 nm)的吸光度值,并计算染料脱色率,以此表示菌株的脱色能力,计算公式为:

其中,A为不接种菌液的吸光度值;B为接种菌液的吸光度值。

1.6 菌种鉴定

(1)菌株的生理生化特征实验方法及初步鉴定见《常见细菌系统鉴定手册》。

(2)16S rDNA序列分析。经基因组DNA提取后和PCR扩增,PCR产物的琼脂糖凝胶电泳以总 DNA 为模板,利用引物 8F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和 1492R(5′-GGT TAC CTT GT T ACG ACT T-3′)进行PCR扩增,扩增程序为:95℃变性5 min;94℃变性1 min,53℃退火45 s,72℃延伸90 s(28个循环);最后72℃延伸10 min。PCR产物直接用于测序获取碱基序列。用NCBI的BLAST进行碱基序列比对,确定各分离菌株的系统分类。

1.7 菌株最适脱色培养基的确定

基本操作同1.5。采用不同碳源、氮源和磷酸盐在相同的培养条件下(30℃,接种量5%,pH值为7.2)静置培养,以脱色率为指标,确定最佳培养基组分,每组脱色实验均重复3次,同时分别设未加菌的灭菌培养基在同等条件下作空白对照。

1.8 菌株脱色特性的研究

基本操作同1.6。固定其它条件,改变1个参数,考察 pH 值(5～10)、温度(15～40 ℃)、溴氨酸初始质量浓度(25～1000 mg/L)、接种量(1%～10%)及氯化钠质量浓度(0～25 g/L)对脱色的影响,每组实验均重复3次,同时分别设未加菌的灭菌培养基在同等条件下作为空白对照。

2 结果与讨论

2.1 脱色菌分离筛选结果

经分离筛选得到1株对溴氨酸具有较高脱色能力的菌株,命名为E2,该菌株在pH=7.0,30℃,静置培养48 h对质量浓度小于400 mg/L的溴氨酸脱色率均可达到80%以上。文献[6]研究指出,菌株Flavobacterium sp可使120 mg/L的溴氨酸在72 h后脱色,在48 h内虽有菌体生长,但溴氨酸并不脱色。由对比可知 E2是一株高效溴氨酸脱色菌。

2.2 菌株E2的生理生化特征鉴定

该菌株为革兰氏阴性菌,菌落形状呈圆形,直径1～2 mm,隆起,边缘整齐,表面光滑湿润有光泽,乳白色不透明。菌株E2的主要生理生化特征见表1所列。

根据形态、生理生化特征,初步鉴定该菌株属于肠细菌属。

表1 菌株E2的主要生理生化特征

2.3 菌株E2的16S rDNA序列分析

将菌株E2的16S rDNA的序列提交NCBI网站进行序列对比,该菌株16S rDNA在NCBI网站编号为15900967,与菌株库AJ853891中模式菌株Enterobacter ludwigii的16S rDNA序列同源性最高(99%)。

综合生理生化特征、形态观察和16S rDNA序列分析,初步鉴定菌株E2为Enterobacter ludwigii。

2.4 最适脱色培养基组成的确定

(1)碳源选择及最适碳源质量浓度实验。碳源种类对菌株脱色的影响如图1所示。不同的碳源对菌株E2的脱色能力有明显影响。葡萄糖作碳源时,细菌的脱色率最高,蔗糖次之,淀粉、乙醇和甘油作碳源时,细菌脱色率较差。不加碳源以溴氨酸为唯一碳源时,E2菌株几乎没有表现出脱色能力,可以认为此菌株不能够利用溴氨酸为唯一碳源进行生长代谢。由于污泥驯化时采用葡萄糖作为外加碳源,故以下实验均延续采用外加葡萄糖来提高E2菌株对溴氨酸的脱色率。

葡萄糖质量浓度对脱色的影响如图2所示。葡萄糖质量浓度对菌株 E2的脱色率有很大影响。葡萄糖质量浓度在1～2 g/L范围内脱色率最高,在80%左右。继续提高葡萄糖质量浓度,脱色率反而会降低,可能是当葡萄糖质量浓度增大到一定程度时,细菌的生长主要依靠葡萄糖而对染料没有产生代谢作用。考虑到添加葡萄糖会增加处理成本,本实验建议葡萄糖投加量取1 g/L。

图1 碳源种类对菌株脱色的影响

图2 葡萄糖质量浓度对脱色的影响

(2)氮源选择及最适氮源质量浓度实验。氮源种类对菌株脱色的影响如图3所示。菌株可利用多种氮源对溴氨酸进行降解,当以硫酸铵作为氮源时菌株对溴氨酸的脱色率最高,达到84.9%。当氯化铵和尿素作为氮源时脱色率也较高,分别达到74.9%和72.1%,且在不外加氮源的情况下,菌株E2也表现出一定的脱色率,但为了提高脱色率,选用硫酸铵为最适氮源。硫酸铵质量浓度对脱色的影响如图4所示,在所考查范围内,硫酸铵质量浓度对菌株脱色影响不大,但比不加氮源脱色率要大,故培养基中硫酸铵质量浓度取0.5 g/L。

图3 氮源种类对菌株脱色的影响

图4 硫酸铵质量浓度对脱色的影响

(3)磷酸盐对脱色率影响实验。以1 g/L葡萄糖为最适碳源,0.5 g/L硫酸铵为最适氮源,在培养基中分别添加 25 mg/L KH2PO4和K2HPO4,并以不加磷酸盐为对照,考察磷酸盐对脱色率的影响。

结果如下:加KH2PO4与K2HPO4的脱色率分别为85.75%和80.82%,不加磷酸盐时,脱色率为77.22%。由此可知,添加磷酸盐并没有较大幅度地提高菌株的脱色率,说明磷酸盐不是影响溴氨酸脱色的决定性因素,只是起到一定的促进作用。

2.5 菌株脱色条件的研究

(1)pH值对菌株脱色的影响。pH值对菌株脱色的影响如图5所示。在pH值为7、8时,该菌表现出较强的脱色能力;酸性条件下脱色效果不佳,溴氨酸基本上不能脱色;中性及稍偏碱性环境中,溴氨酸脱色效果较好,故最适 pH值为7～8。

(2)温度对菌株脱色的影响。温度对菌株脱色的影响如图6所示。在30、35℃时脱色菌对染料的脱色率大约在85%左右。当温度达到40℃时,染料的脱色率反而下降。可能是温度过高超过了细菌所能适应的温度,菌的酶系统被破坏,导致该菌活性下降甚至死亡,而使脱色能力下降。温度低于30℃时,脱色率随温度的降低而降低,可能是温度过低不利于细菌的生长,酶的活性降低,以致脱色率降低。可见菌株E2的适宜生长温度范围是30～35℃。

图5 pH值对菌株脱色的影响

图6 温度对菌株脱色的影响

(3)不同接种量对菌株脱色的影响。接种量对菌株脱色的影响如图7所示。当接种量为5%时,脱色率就可以达到80.2%,此后随着接种量的增大,脱色率有所升高,但升幅并不大,而当接种量小于3%时,可能由于菌量较少,菌体生长较慢,脱色率较低。综合考虑,以5%接种量为最适接种量。

图7 接种量对菌株脱色的影响

(4)溴氨酸质量浓度对菌株脱色的影响。溴氨酸质量浓度对菌株脱色的影响如图8所示。随溴氨酸质量浓度增加,菌株脱色率相应下降。溴氨酸质量浓度小于400 mg/L时,菌株E2表现出了优异的脱色性能,脱色率达到80%左右,溴氨酸质量浓度为1 000 mg/L时,脱色率很低,菌体呈颗粒状沉于底部,菌体呈现红色,说明溴氨酸对菌株E2具有一定的生长抑制毒性。

(5)盐度对菌株脱色的影响。染料生产废水通常盐度很高,因此考察盐度对菌株E2脱色的影响在实际废水处理中具有重要意义。盐度对菌株脱色的影响如图9所示,不加氯化钠时脱色率最高,菌株在低盐度时具有比高盐度时更高的脱色率,但是差别不大,说明菌株E2本身具有一定的耐盐性。

图8 溴氨酸质量浓度对菌株脱色的影响

图9 盐度对脱色率的影响

(6)溴氨酸脱色产物初步分析。溴氨酸脱色前后吸收光谱图如图10所示。

图10 溴氨酸脱色前后的吸收光谱图

溴氨酸的紫外特征吸收峰在232 nm和250 nm附近,可见部分特征吸收峰在485 nm处,经过菌株E2作用后,溴氨酸吸收光谱发生了显著的变化,在整个紫外可见光范围内吸收显著降低,并且最大吸收峰向短波方向偏移,在410 nm附近出现新的吸收峰,说明溴氨酸共轭体系——蒽醌环结构被破坏,但并未完全降解。这与文献[9]的研究相一致,溴氨酸生物脱色后环状结构被破坏,生成新产物,且此产物的最大吸收波长为410 nm。

3 结 论

(1)从本实验室处理溴氨酸废水的ABR反应器污泥中筛选到1株溴氨酸脱色菌E2,该菌株可使质量浓度低于400 mg/L的溴氨酸的脱色率达80%以上,最高脱色率可达90%。

(2)经生理生化、形态学及16S rRNA鉴定,菌株E2为Enterobacter ludwigii。

(3)该菌株最佳脱色培养基中碳、氮源组成分别为:葡萄糖1 g/L,硫酸铵0.5 g/L。磷酸盐对脱色无显著影响。

(4)该菌株对溴氨酸最适脱色条件分别为:pH 值7～8,温度30～35℃,接种量为5%。该菌株具有一定的耐盐性。

(5)溴氨酸经菌株E2降解后紫外可见吸收光谱发生了显著的变化,环状结构被破坏,生成新产物,此产物的最大吸收波长为410 nm。

[1] 樊 丽,刘冬启,朱顺妮,等.菌株S phingomonas sp F L降解溴氨酸的特性研究[J].环境科学,2008,29(9):2618-2623.

[2] 李 莹,蔡宝立,庄源益,等.溴氨酸脱色菌的筛选及其特性的初步研究[J].工业水处理,2002,22(2):22-24.

[3] Pearce C I,Lloyd J R,Guthrie J T.The removal of colour from textile wastewater using whole bacterial cells:a review[J].Dyes and Pigments,2003,58:179-196.

[4] 曲媛媛,周集体,王 竞,等.溴氨酸降解菌株的分离鉴定及特性研究[J].环境科学学报,2005,25(6):785-790.

[5] 林文莲,吕 红,周集体,等.鞘氨醇单胞菌完整细胞对溴氨酸的好氧降解[J].环境科学与技术,2007,30(6):32-34.

[6] 辛宝平,庄源益,邹其猛,等.黄杆菌(Flavobacterium sp.)对溴氨酸脱色的研究[J].中国环境科学,2000,20(4):332-336.

[7] 黄丽萍,周集体,王 竞,等.菌株 HP3对溴胺酸的降解机理[J].中国环境科学,2001,21(2):180-184.

[8] 许玫英,郭 俊,岑英华,等.染料的生物降解研究[J].微生物学通报,2006,33(1):138-143.

[9] 金若菲,王 竞,张劲松,等.蒽醌染料中间体的微生物降解脱色研究[J].环境科学研究,1999,12(6):32-35.