HPLC法测定精氨酸布洛芬喷雾剂的含量

张 皓，杨金荣，高顺昌，王润玲，程先超，周 慧

（天津医科大学药学院，天津 300070）

布洛芬是临床上常用的非甾体消炎镇痛药，具有较强的抗炎、抗风湿及解热镇痛作用，但长期口服布洛芬对胃肠道会产生副作用。布洛芬是非选择性环氧化酶抑制剂,环氧化酶有两种亚型：COX-1和COX-2。COX-1是一种结构酶，存在于肠、胃、肾等大多数组织中，通过促进PG及血栓烷A2的合成，保护胃肠道黏膜、调节肾脏血流和促进血小板聚集等内环境稳定[1]；而COX-2为诱导酶，在大多数正常组织中通常检测不到，主要在炎症部位由炎症介质诱导产生活性，通过对PG合成的促进作用，介导疼痛、发热和炎症等反应的发生[2]。布洛芬的治疗作用源于对COX-2的抑制[3]，而不良反应归于对COX-1的抑制[4]。由于COX-2在炎症部位诱导产生，所以，在局部炎症部位给药，实际起到了靶向作用。本课题组研制了布洛芬水溶性衍生物精氨酸布洛芬[5-6]，并以其为原料制备了外用喷雾剂，改变了口服给药途径，通过透皮吸收而达到疗效，克服了口服给药对胃肠道的副作用。目前，该课题组研制的精氨酸布洛芬原料已经获得国家颁发的新药证书。其喷雾剂已完成处方筛选等工作，其体外透皮吸收试验结果表明，该处方的平均渗透速率（8 h）为 847.69 μg·h-1，是一个很有应用前景的外用喷雾剂。本文对该制剂的含量测定方法进行了研究探讨。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 LC-10A高效液相色谱仪（LC-10Atvp高压输液泵、SPD-10Avp紫外检测器、Anastar色谱工作站，日本岛津），BP211D型电子分析天平（Sartorius），HH-恒温水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂)，pHS-3C精密pH计（天津市盛邦科学仪器技术公司）。

1.2 样品与试剂 精氨酸布洛芬对照品（自制，三次重结晶，在含量测定色谱条件下显单一色谱峰，含量99.8%）、精氨酸布洛芬原料（自制，含量99.6%）、精氨酸布洛芬喷雾剂（自制，标示含量92.5mg/ml）、重蒸水（自制）、甲醇（色谱纯，天津市康科德色谱试剂公司），磷酸、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil-C18（150mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇－磷酸盐缓冲液（75∶25），用磷酸调pH 至 3.0，流速为 1.0ml/min，检测波长为220 nm，进样量为20μl，柱温为30℃。

2.2 溶液的配制 （1）对照品溶液的配制：精密称取精氨酸布洛芬约0.37 g，置于100ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液；精密量取上述储备液2.5ml至25ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。（2）供试品溶液的配制：精密量取精氨酸布洛芬喷雾剂1.0ml，置于25ml容量瓶中，加适量流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1ml，置于10ml容量瓶中，加流动相至刻度，即得供试品溶液。（3）空白样品溶液的配制：按处方配制不含精氨酸布洛芬的空白样品，精密量取空白样品1.0ml，置于25ml容量瓶中，加适量流动相稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置于10m l容量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得空白样品溶液。

2.3 色谱条件的专属性 分别精密量取空白样品溶液、对照品溶液和供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图（图1~3）。

2.4 方法学试验

2.4.1 线性关系考察 精密称取精氨酸布洛芬对照品约0.185 g，置于50ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液2、2.25、2.5、2.75、3.0ml，分别置于 25ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度（浓度分别0.296、0.333、0.370、0.407、0.444mg/ml）。分别精密量取 20 μl注入液相色谱仪，在220 nm波长处测定峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。得线性回归方程为y=24 820 154 x+184 692,r=0.999 9。

2.4.2 精密度试验 取标准曲线项下，浓度为0.370mg/ml的溶液，连续测定6次，计算所得峰面积的相对标准偏差为0.31%。

2.4.3 精氨酸布洛芬溶液的稳定性试验 取标准曲线项下，浓度为 0.370mg/ml的溶液，在 0、1、2、4、6、8、10、24 h测定峰面积，计算所得峰面积的相对标准偏差为1.29%。

2.4.4 回收率试验 精密称取精氨酸布洛芬0.37 g，置于100ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液，精密吸取2.5m l至25ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。按照2.1的色谱条件进行测定[7-8]。

按比例精密量取全辅料溶液（空白样品），置50 ml容量瓶中，精密加入相当于标示量80%、100%和120%的精氨酸布洛芬，混合均匀，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置10ml容量瓶中，以流动相稀释定容，摇匀，过滤，按照2.1的色谱条件进行测定，计算回收率[9-11]，结果见表1。

2.4.5 样品含量测定 按上述方法测定3批样品（批号分别为 070901、070902、070903）含量，结果显示3批样品中精氨酸布洛芬含量（n=3）分别为91.2、92.9、92.0mg/ml。

表1 回收率测定结果(n=3)

3 讨论

关于色谱条件的选择，考虑到保留时间的长短会从不同角度影响实验结果，保留时间短时，分离度可能达不到完全分离的要求，保留时间长时，浪费时间和试验试剂，故对可能影响保留时间的各因素进行了如下摸索。

3.1 流动相的比例 甲醇:磷酸盐缓冲液分别为75:25，73:27和77:23，其它条件不变。结果显示调整流动相比例时，对峰面积影响不大，甲醇比例升高，则保留时间缩短，甲醇比例降低，则保留时间延长，分离度升高，但也能达到分离度＞2的要求。

3.2 柱温 温度分别为30℃，25℃和35℃，其它条件不变。调整柱温时，对峰面积影响不大，升高温度，则保留时间缩短，但分离度不如正常柱温的好，但也能达到分离度＞2的要求；降低温度，则保留时间延长。

3.3 流速 流速分别为 1 ml/min，0.9 ml/min和1.1ml/min，其它条件不变。调整流速，对峰面积有一定的影响，流速增加，峰面积减小，保留时间缩短，降低流速，峰面积增大，保留时间延长。

笔者采用HPLC法确定精氨酸布洛芬喷雾剂的含量测定方法，并进行了方法学验证。标准曲线为：y=24 820 154 x+184 692,r=0.999 9；在 0.290～0.400 mg/ml范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，方法的精密度及回收率均符合中国药典2005版第二部的要求。本含量测定方法简便、准确可靠、精密度良好，可作为精氨酸布洛芬喷雾剂的定量控制方法。

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