离子交换固相萃取高效液相色谱联用法检测食品中的5-羟甲基糠醛

张 燕，郭天鑫，于 姣，丰 帆，王 硕*

(食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

离子交换固相萃取高效液相色谱联用法检测食品中的5-羟甲基糠醛

张 燕，郭天鑫，于 姣，丰 帆，王 硕*

(食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

为提高分析方法的准确性，优化建立一种定量检测各类食品中5-羟甲基糠醛含量的高效液相色谱方法。采用离子交换固相萃取柱代替传统的C18固相萃取柱进行前处理，与高效液相色谱联用，提高了方法的回收率和精密度。在0.01～12mg/L质量浓度范围内，5-羟甲基糠醛质量浓度和色谱峰面积线性关系好(R2=0.9998)，方法检出限(RSN=3)为3.42μg/L。在0.1、0.5、1mg/kg 3种质量浓度添加水平内，5-羟甲基糠醛的添加回收率为85%～103%，RSD为0.31%～3.83%。采用该方法对13种样品进行测定，结果表明该方法能够用于食品中5-羟甲基糠醛含量测定。

5-羟甲基糠醛；离子交换固相萃取；高效液相色谱；食品

Abstract：An ion exchange solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatographic method was presented and optimized in order to improve its sensitivity and accuracy. In this method, ion exchange solid-phase extraction column was used for pretreatment instead of conventionally used C18 solid-phase extraction column so that method recovery and accuracy could be both improved. This method exhibited a good linear relationship over the 5-hydroxymethyl-furfural (5-HMF) concentration range of 0.01 to 12 mg/L (R2=0.9998). The detection limit of this method was 3.42 μg/L. The recovery rates for 5-HMF spiked at levels of 0.1, 0.5 mg/L and 1 mg/L were between 85% and 103% with a relative standard deviation varying from 0.31%to 3.83%. Determination of 5-HMF in 13 real samples was performed using this method, and the results demonstrate that this method is applicable to determine 5-HMF in food.

Key words：5-hydroxymethyl-furfural；ion-exchange solid phase extraction；HPLC；food

随着食品安全受到全社会普遍关注，食品中5-羟甲基糠醛成为新的研究热点。5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF)，也叫5-羟甲基-2-呋喃甲醛(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde)，是葡萄糖、果糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的醛类化合物[1-5]。食品工业中美拉德反应和焦糖化反应也能产生5-HMF[6-8]。据报道，5-HMF有一定程度的毒副作用，对眼、黏膜、皮肤有刺激性，过量食用会引起中毒，造成动物横纹肌麻痹和内脏损害[5-10]。有相关文献报道5-HMF的每日允许摄入量为30～60mg[11]。

国内的研究主要集中在医药领域的葡萄糖注射液和中药成分中5-HMF的含量检测[12-13]，检测方法通常为比色法、双波长法、紫外分光光度法、硫代巴比妥酸法[14]，而国外集中在食品领域中的检测，如蜂蜜[15]、咖啡[16]、饮料[17]等，检测方法有液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)等技术。

食品基质复杂，对于样品前处理的要求较高，实验发现，依据文献[18]报道的分析方法，采用C18固相萃取柱处理样品后，5-HMF的回收率较低，本实验拟研究建立一种能有效提高5-HMF回收率的固相萃取前处理方法，从而提高方法的准确度和灵敏度，使其可以用于多种食品中5-HMF含量的准确测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

面包、咖啡、蜂蜜、葡萄酒、酱油、麻花、薯片等食品均购于当地超市；5-羟甲基糠醛(纯度99%)Sigma公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色谱纯) 天津康科德科技有限公司；乙酸锌、亚铁氰化钾等(均为国产分析纯)。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；HYPERSIL ODS-2 C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱、HyperSep Retain PEP固相萃取柱、HyperSep C18固相萃取柱 美国Thermo公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司；QL-901型涡旋振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；KQ-500B型超声波离心机 昆山市超声仪器有限公司；SPE固相萃取装置 美国Supelco公司；AGT Cleanert PCX固相萃取柱 天津艾杰尔公司。

1.3 方法

1.3.1 系列浓度标准溶液的制备

称取5-羟甲基糠醛标准品40mg(精确至0.0001g)，用超纯水溶解并定容于100mL容量瓶里，制成0.4mg/mL的标准储备液，再用超纯水稀释成0.01、0.1、0.4、1、4、8、12mg/L工作溶液。

1.3.2 液相色谱条件

色谱柱：HYPERSIL ODS-2 C18(4.6mm×250mm，5μm)；UV检测器：检测波长284nm；流动相：甲醇-水(15:85，V/V)；柱温35℃；流速0.6mL/min；进样量20μL。

1.3.3 样品制备

分别取5g(精确至0.001g)咖啡、面包、蜂蜜、麻花和薯片样品溶于少量超纯水中，添加1 mL乙酸锌(150g/L)和1mL亚铁氰化钾(300g/L)，振荡提取3min，再经超声波提取10min，转入离心管中离心10min(5000r/min)，转移澄清液于50mL容量瓶里；沉淀物再经超纯水提取一次，合并上清液，用超纯水定容于50mL容量瓶里。从容量瓶里取样品澄清液10mL过SPE固相萃取。

准确吸取葡萄酒10mL，超声波脱气10min，脱气样品过SPE固相萃取。

准确吸取酱油5 m L，用乙酸乙酯经振荡提取两次，合并提取液并定容至50mL，取10mL溶液过SPE固相萃取。

1.3.4 固相萃取方法

离子交换固相萃取柱使用前，首先用5mL甲醇过萃取柱，接着用5mL超纯水淋洗萃取柱，保持萃取柱湿润，上样10mL(控制流速每两秒1滴)，5mL纯水淋洗除杂，10mL甲醇洗脱，氮吹至干，用0.5mL流动相溶解，过0.45μm针筒式滤膜，待HPLC分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

通过优化流动相组分、比例和流速，观察对应的色谱峰型，当流动相组分为甲醇-水(15:85，V/V)，等浓度洗脱，流动相流速0.6mL/min，检测波长284nm时，5-HMF标准溶液的色谱峰图形最好，见图1。如果流动相的流速过大，出峰时间早，基质干扰影响大，不利于实际样品的测定。

图1 5-HMF标准溶液液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of 5-HMF standard solution

2.2 线性关系和检出限

系列质量浓度的5-HMF标准溶液依次经优化的高效液相色谱条件进行分析，以质量浓度为横坐标、对应色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，见图2。检测方法在0.01～12mg/L质量浓度范围内线性回归方程为y=217584x+4051，R2=0.9998。根据3倍信噪比计算得到方法检出限为3.42μg/L。

图2 5-HMF标准曲线Fig.2 Standard curve of 5-HMF

2.3 固相萃取柱的选择

实验比较了3种固相萃取柱，C18固相萃取柱、PEP固相萃取柱和PCX离子交换固相萃取柱。C18是以硅胶为基质的未封端的反相萃取柱，是极性和非极性化合物萃取的通用型固定相；PEP官能化聚苯乙烯-二乙烯苯萃取柱，表面同时具有亲水性和憎水性基团，对各类极性和非极性化合物具有较均衡的吸附作用，其吸附能力强于C18键合硅胶；PCX是以阳离子交换混合机理的水可浸润型聚合物为基质的萃取柱，提供双重保留模式，即离子交换与反相保留。分别对上样量和净化条件(洗杂、洗脱条件)进行优化。以5-HMF标准溶液的吸附动力曲线为评价指标，结果发现PCX离子交换固相萃取柱吸附效果最好，PEP固相萃取柱次之，C18固相萃取柱效果最差，见图3。

图3 3种固相萃取材料的动态吸附饱和容量曲线Fig.3 Dynamic adsorption saturation capacity curve for three kinds of solid-phase extraction materials

因此选择PCX固相萃取柱作为样品前处理柱，分别对淋洗除杂、溶剂洗脱条件进行优化。实验分别比较了纯水、10%、20%及30%甲醇溶液的淋洗除杂效果，结果发现10%、20%、30%甲醇溶液均能不同程度地洗下目标物，而纯水没有，故选择纯水洗杂。分别选用甲醇、乙腈、乙酸乙酯做洗脱剂，实验发现，乙腈洗脱效果略低于甲醇，乙酸乙酯洗脱后在紫外有干扰，故选择甲醇作为5-HMF洗脱液。优化后所得固相萃取纯化条件为上样体积10mL、5mL纯水洗杂、10mL甲醇洗脱。

2.4 样品添加回收率和精密度

为了评价所建立方法的精密度，实验选择咖啡、面包、蜂蜜和葡萄酒4种样品，分别添加0.1、0.5、1mg/kg 3种质量浓度的5-HMF标准工作溶液，经SPE前处理后，用高效液相色谱仪检测，每种质量浓度平行测定3次，计算添加回收率和RSD值，实验结果见表1。在3个添加水平上，5-HMF的回收率为85%～103%，RSD值为0.31%～3.83%，说明方法准确度和精密度均能达到常规定量方法的要求，能够准确用于食品中5-HMF含量的测定。

表1 各样品添加回收率和RSDTable 1 Recovery rates of each sample and corresponding relative standard deviations

2.5 实际样品测定

分别选择市售的2种咖啡、2种面包、2种蜂蜜、2种葡萄酒、3种不同品牌的酱油、麻花和薯片，样品经所优化建立的离子交换固相萃取前处理后，基质干扰减少，提高了样品检测灵敏度，便于HPLC定量分析检测，测得各样品中5-HMF的含量见表2。图4为酱油样品色谱图。

图4 酱油样品HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of soy sample

表2 各样品中5-HMF的含量Table 2 5-HMF content in each sample

3 结 论

通过对不同种类样品的固相萃取柱前处理条件和液相色谱分析条件的优化，研究建立了定量检测各类食品中5-HMF含量的离子交换固相萃取-液相色谱检测方法。在质量浓度0.01～12mg/L范围，高效液相色谱检测方法线性良好(R2=0.9998)，灵敏度高，方法检出限为3.42μg/L，样品添加回收率达85%～103%，RSD为0.31%～3.83%。与C18固相萃取柱相比，采用离子交换固相萃取柱净化，提高了5-HMF回收率。用所建立方法对多种食品进行了测定，除葡萄酒和薯片中未检出5-HMF外，其他热加工食品均含有不同量的5-HMF，有关5-HMF生成机理还需深入探讨。

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Development of Ion-exchange Solid Phase Extraction and High Performance Liquid Chromatography for the Determination of 5-Hydroxymethyl-furfural in Food

ZHANG Yan，GUO Tian-xin，YU Jiao，FENG Fan，WANG Shuo*
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, Faculty of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

R155.5

A

1002-6630(2010)18-0212-04

2009-12-25

“十一五”国家科技支撑计划项目(2008BAD91B04)

张燕(1970—)，女，教授，博士，研究方向为食品安全与检测。E-mail：yzhang@tust.edu.cn

*通信作者：王硕(1969—)，男，教授，博士，研究方向为食品安全与检测。E-mail：s.wang@tust.edu.cn