星点设计-效应面法优选短梗五加叶中金丝桃苷的提取工艺

陆 珞，关 键，蔡恩博，徐 蕊，徐春玲，徐海金，郑友兰*

(吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118)

星点设计-效应面法优选短梗五加叶中金丝桃苷的提取工艺

陆 珞，关 键，蔡恩博，徐 蕊，徐春玲，徐海金，郑友兰*

(吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118)

目的：星点设计-效应面法优选短梗五加叶中金丝桃苷的提取工艺。方法：以乙醇体积分数、提取时间、溶媒比为主要影响因素，金丝桃苷提取率为评价指标，通过对主要因素各水平的多元线性回归及二项式拟合，用岭嵴分析和效应面法选取最佳工艺，并进行预测分析。 结果：确定金丝桃苷最佳提取工艺为乙醇体积分数69.80%，溶媒比23.17，超声提取时间86.56min。结论：星点设计-效应面法优选的短梗五加叶中金丝桃苷的提取工艺，方法简便，精密度高。

短梗五加；星点设计；效应面法；金丝桃苷；工艺优化

Abstract：Objective:To develop an optimal process for hyperin extraction fromAcanthopana sessiliflorus(Rupr.et Maxim.)leaves. Methods:The major factors affecting hyperin extraction yield were ethanol concentration, extraction time and liquid-tosolid ratio. They were optimized using central composite design and response surface methodology. Multiple linear regression and quadratic polynomial fitting of experimental data obtained from central composite design were carried out to set up a mathematical model with hyperin extraction yield as a function of the above factors. Their optimal values were chosen using ridge analysis and verified experimentally. Results:The optimal conditions for the extraction of hyperin were found to be:ethanol concentration 69.80%, liquid-to-solid ratio 23.17:1 and extraction time 86.56 min. Conclusion:Central composite design and response surface methodology are suitable for optimizing the extraction of hyperin fromAcanthopana sessiliflorusleaves.This method is simple, convenient and accurate.

Key words：Acanthopanax sessiliflorus；central composite design；response surface methodology；hyperin；optimization

短梗五加[Acanthopanax sessiliflorus(Rupr.et Maxim.)Seem.]为五加科五加属植物，分布于东北、华北、陕西等地[1]。性温，味辛，无毒，具滋补强壮、祛风除湿等功效[2]。其根皮为我国传统中药，其茎﹑叶也可作药用。一直以来，短梗五加是辽东山区特有的药膳两用植物，其嫩茎和叶可做蔬菜或制茶，市场上已开发出短梗五加苦茶，具有减肥、降血糖、镇静安神之功效。本研究通过试验检测出短梗五加叶内含有金丝桃苷，且含量较大。现代医学研究表明金丝桃苷具有良好的治疗慢性气管炎、哮喘的作用，并对缺血性脑损伤有很好的保护作用[3-5]，因此把金丝桃苷作为衡量短梗五加叶质量的重要指标。本实验以短梗五加叶中金丝桃苷含量的提取率为指标，对其采取归一化法处理，优选出合理的短梗五加叶提取条件，为进一步开发短梗五加相关的产品提供依据。星点设计(central composite design，CCD) 是国外近年常用的实验优化方法，具有可采用非线性拟合的特点，其结果可采用集数学与统计学方法于一体的效应面法进行优化[6]，能准确找到较佳的工艺参数。本实验应用星点设计-效应面法即采用非线性数学模型拟合，在中心点进行重复性实验以提高实验精度，预测值更接近真实值，且实验次数也较少[7]，从而优选出短梗五加叶中金丝桃苷的最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

短梗五加叶采集于吉林省临江市老岭基地，经由吉林农业大学园艺学院胡全德教授鉴定为短梗五加[Acanthopanax sessiliflorus(Rupr.et Maxim.)Seem]样品。

金丝桃苷对照品 中国药品生物制品检定所；甲醇(色谱纯)；双蒸水(经微孔滤膜滤过)；冰醋酸(分析纯)、乙醇(分析纯) 北京化工厂。

1.2 仪器与设备

ALLTECH高效液相色谱仪；KQ-250DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；电子天平(500g/0.001g) 金羊天平仪器厂；百灵LA114型电子天平(110g/0.0001g) 常熟市百灵天平仪器有限公司；101-2型数显电热鼓风干燥箱 上海锦屏仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金丝桃苷含量测定方法的建立

1.3.1.1 色谱条件

色谱柱：ODS-C18(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长：360nm；流动相：甲醇-0.1%冰醋酸溶液(55:45，V/V)；体积流量：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长360nm；进样量10μL。

1.3.1.2 供试品溶液的制备

取干燥至质量恒定的短梗五加叶粗粉约1.0g，精密称量，置于锥形瓶中，精密加入一定体积分数的乙醇30mL，密封称量溶液总体质量并记录，浸泡过夜，超声提取，静置至室温，用乙醇补足溶液总体质量，提取液过滤，蒸干，精密加入20mL甲醇将残渣完全溶解，用孔径为0.45μm滤膜滤过，即得供试品溶液。

1.3.1.3 对照品溶液的制备

精确称取金丝桃苷对照品2.000mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成质量浓度为0.2mg/mL的金丝桃苷对照品溶液。

1.3.1.4 标准曲线的绘制

吸取上述对照品溶液，分别进样2、4、8、12、16μL，按上述色谱条件进行HPLC分析，以峰面积和进样量进行线性回归，金丝桃苷线性方程为Y=1481576.6311X－138220.1402(R2=0.9997，n=5)，线性范围0.4～3.2μg。其中Y是峰面积，X为进样体积。

1.3.1.5 重现性实验

取短梗五加叶样品，按照1.3.1.2节的方法，重复制备5份供试品溶液，分别测定，结果金丝桃苷金丝桃苷峰面积的RSD(相对标准偏差)为1.95%，表明方法重复性良好。

1.3.1.6 精密度实验

取短梗五加叶样品，制备供试品溶液，连续进样5次，结果金丝桃苷峰面积的RSD为1.46%。表明仪器精密度良好。

1.3.1.7 稳定性实验

取短梗五加叶样品，制备供试品溶液，分别于1、2、3、4、5h进样，结果金丝桃苷峰面积的RSD为1.63%。表明供试品溶液在5h内稳定。

1.3.1.8 加标回收率实验

精密称取短梗五加叶粉末样品1.000g，平行5份，加入一定量的金丝桃苷对照品，制备供试品溶液，进行测定，计算得金丝桃苷平均回收率为98.45%，RSD为1.48%。

1.3.1.9 样品测定

将样品供试液在1.3.1.1节选定的色谱条件下进行分析，将其峰面积代入相应的回归方程，并按以下公式计算金丝桃苷的提取率。

1.3.2 试验选择提取因素及相关水平

1.3.2.1 乙醇体积分数范围的选择

[6]，当每次提取90min，加10倍量的溶剂，比较体积分数0、30%、50%、70%、90%乙醇对指标值的影响，结果显示以水为溶剂对金丝桃苷的提取率偏低，以体积分数大于30%的乙醇为溶剂对指标值能达到较好的提取效果，所以选择乙醇体积分数的下限为30%、上限为90%。

1.3.2.2 提取时间范围的选择

本实验采用超声提取的方法，超声功率80W、提取温度为30℃、提取时间范围确定为10～90min以确定佳提取时间。

1.3.2.3 溶媒比范围的选择

根据经验在中药提取中，溶媒比一般为15倍左右，如果溶剂量太少，浸泡过夜后被药材吸收，导致无法过滤，而溶剂量太大，试剂消耗过大，则需要更大的经济投入，所以溶媒比选择范围为12～30倍。

1.3.3 星点设计

表1 星点设计因素与水平Table 1 Factors and levels in the central composite design

各因素水平设计见表1，按星点设计方法安排试验，共17组(表2)，分别标号为S1～S17。取干燥至质量恒定的短梗五加叶粗粉约1.0g，精密称定，平行17份，于锥形瓶中按表2处理，提取3次，合并备用，溶液用孔径为0.45μm滤膜滤过。

为了精确考察最佳因素水平值，选取乙醇体积分数(X1)、提取时间(X2)和溶媒比(X3)为自变量，以金丝桃苷提取率(Y)为因变量，采用星点设计-效应面方法设计试验，并用SAS 9.2软件包对实验数据进行RSREG分析，RSREG过程(二次响应面回归过程)用于拟合完全二次响应曲面的回归模型[8]。通过分析研究，拟合出曲面形状的最佳响应的因子水平或范围。这里，Y为响应变量，X1、X2、X3为因子变量，二次响应曲面回归模型为：

RSREG过程具有以下功能：1)模型拟合及对参数估计做方差分析；2)为了调查预测响应曲面的形状而进行典型性相关分析；3)为了寻找最佳响应的范围而进行岭嵴分析，由此可以精确得出最佳响应值时各因子的取值，同时，还可以以指标值为纵坐标，固定3个自变量之一为所估计的最佳值上，其他两个自变量为横坐标，用Origin 8.0绘制三维效应面(response surface)图。由图中的指标值选取最佳自变量值，最后用效应面法得出的最佳工艺条件提取药材，并依据模型进行预测分析，进行验证试验，最终得到优化的提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 星点试验结果

星点试验结果见表2。

表2 星点试验设计与结果Table 2 Central composite design arrangement and experimental results

2.2 二次响应面回归分析结果

应用SAS 9.2软件包对试验数据进行二次响应面回归分析，得到的完全二次响应曲面的回归模型为：

R=0.896，拟合不足检验概率P=0.071。

由于这个回归模型的相关系数均较大，且拟合不足检验概率均大于0.05，说明模型较优。通过岭嵴分析，得出回归模型的最佳响应点为金丝桃苷(Ymax)=0.1338(X1=69.80，X2=86.56，X3=23.17)。

2.3 效应面法优化提取工艺和预测

根据拟合的二次回归方程，用Origin 8.0绘制三维效应面图(图1)，从图1可以直观看出，金丝桃苷收率较高的提取工艺范围为：X1：50%～65%，X2：70～90min，X3：26～30。

根据确定的最优提取工艺，分别取3份样品，进行验证实验，并将测定的平均结果与拟合方程的预测值进行比较，并计算其相对偏差。

验证实验测定的平均结果与拟合方程的预测值相对偏差分别为1.11%、1.38%，证明该方法可靠。

3 讨 论

3.1 本实验采用了星点设计，除了充分考虑到各因素间的相互作用外，且设计方法简单、实验次数少。在中心点进行重现性实验，以提高实验精度。同时采用非线性数学模型拟合，复相关系数较高，可信度较好，预测值更接近真实值，星点设计实验所得的信息量更大、更直观，更适合于探索性的试验研究。

3.2 目前国内关于短梗五加叶金丝桃苷含量测定的文献较少，本实验采用高效液相法测定短梗五加叶中金丝桃苷的含量，测定结果表明，该方法稳定性和重现性均较好，杂质干扰小，是一种较理想的含量测定方法。同时，高效液相法所测得的短梗五加叶中金丝桃苷的含量较大，因此本实验可为金丝桃苷作为衡量短梗五加叶质量的重要指标提供参考依据。

3.3 将乙醇的体积分数、提取时间、溶媒比作为短梗五加叶中金丝桃苷提取率的主要因素，在试验设计中，各因素间往往相互影响，所以不能只考虑单个因素的影响。为了避免乙醇的体积分数、提取时间和溶媒比这3个因素间的交互作用对金丝桃苷提取率的影响，本实验采用星点设计法综合考虑3因素间的交互作用，并通过效应面法分析得出最佳的提取条件。由实验结果知，采用23.17倍量69.80%乙醇超声提取86.56min，短梗五加叶中金丝桃苷提取率能达到90%以上。短梗五加资源主要集中于辽东地区，但在大连市、北京市、湖北省、上海市等地均有引种栽培，其茎、叶、果在民间有悠久的食用习俗[9]，使用短梗五加叶制成的苦茶具有良好的保健作用，并深受消费者欢迎，通过查阅文献得知，金丝桃苷在临床上对许多疾病有显著的疗效[10]。而通过星点设计-效应面法优选出的工艺可最大化地提取出短梗五加叶中的，为广泛地开发金丝桃苷产品提供一定参考。

参考文献：

[1] 淳于家龙, 郭丽娜, 张常顺. 无梗五加化学成分与药理活性的研究进展[J]. 中国药业, 2002, 11(12):73-74.

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[3] 陈锡林, 熊跃康. 杭州市郊山区药(食)菌类资源调查初报[J]. 浙江中医学院学报, 1995, 19(1):46-48.

[4] 陶遵威. 金丝桃甙药理作用研究进展[J]. 天津药学, 2002, 14(2):14-16.

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[8] 黄燕, 吴平. SAS统计分析及应用[M]. 北京:机械工业出版社, 2006:243-254.

[9] KUNKEL G. Plants for human consumption[J]. Economic Botany,1985, 39(2):393.

[10] 史久良, 吴秉纯, 郭秀芳. 刺五加叶金丝桃甙的分离、鉴定和药理作用[M]. 哈尔滨:黑龙江科学技术出版社, 1981:70-79.

Optimizing Hyperin Extraction fromAcanthopana sessiliflorusLeaves Using Central Composite Design and Response Surface Methodology

LU Luo，GUAN Jian，CAI En-bo，XU Rui，XU Chun-ling，XU Hai-jin，ZHENG You-lan*
(College of Chinese Medicinal Material, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

R284.2

A

1002-6630(2010)18-0046-04

2009-12-14

陆珞(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为新药及其开发。E-mail：luluo04@163.com

*通信作者：郑友兰(1956—)，女，教授，学士，研究方向为天然产物化学。E-mail：caienbo8251@163.com