芦笋叶速溶茶酶法辅助处理工艺研究

蔡广霞，陈季旺,*，王元凤，魏新林

(1.武汉工业学院食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234)

芦笋叶速溶茶酶法辅助处理工艺研究

蔡广霞1，陈季旺1,*，王元凤2，魏新林2

(1.武汉工业学院食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234)

为改善芦笋叶速溶茶加工工艺，添加中性蛋白酶、纤维素酶辅助浸提芦笋叶茶，采用正交试验优化两种酶复合浸提的工艺条件。结果显示：只添加一种酶时，纤维素酶与底物比为12U/g、时间30～60min；中性蛋白酶与底物比为6AU/kg、时间60～90min，黄酮提取率、氨基酸含量均较高。复合酶浸提较佳工艺条件为：纤维素酶和中性蛋白酶与底物比分别为10.56U/g和2.64AU/kg，提取时间50min。在该工艺条件下，芦笋叶黄酮提取率为95.8%，提取液中氨基酸含量为20.1mg/g。

芦笋；速溶茶；中性蛋白酶；纤维素酶；黄酮

Abstract：In order to modify the extraction technology of asparagus instant tea, neutral protease and cellulase was used to improve the extraction efficiency during the extraction of asparagus. The optimal extraction parameters were explored using orthogonal array design. Single factor experimental results indicated that the extraction rate of flavonoids and amino acid content exhibited an obvious improvement under the following conditions:cellulase-to-substrate ratio of 12 U/g and enzymatic hydrolysis time of 30 to 60 min; neutral protease-substrate ratio of 6 AU/kg and enzymatic hydrolysis time of 60 to 90 min. Moreover,the optimal parameters for hydrolysis with compound enzymes were cellulase-to-substrate ratio of 10.56 U/g, neutral proteaseto-substrate ratio of 2.64 AU/kg and enzymatic hydrolysis time of 50 min. The extraction rate of flavonoids was 95.8%, and amino acid content was 20.1 mg/g under these optimal conditions for compound enzymes.

Key words：asparagus；instant tea；neutral protease；cellulase；flavonoids

芦笋，又称石刁柏，是百合科天门冬属多年生草本植物[1]，营养丰富。除蛋白质外，还富含维生素、无机盐、微量元素以及天冬酰胺、天冬氨酸、黄酮类物质等药用成分[2-4]。我国是世界上最大的芦笋种植基地，种植面积和产量约占全世界的40%。目前，芦笋主要用于加工鲜切芦笋、芦笋罐头以及利用其下脚料生产芦笋汁、芦笋醋饮料等[5-7]。在采收蔬菜笋后残留的占植株质量分数70%～80%的枝叶被当作废弃物丢掉，这些废弃物中有些营养成分的含量甚至高于蔬菜笋，这样不仅浪费了资源，而且枝叶易腐败发臭，造成了环境污染，因此，开发芦笋叶速溶茶有利于合理利用芦笋资源，提高芦笋加工的附价值。

速溶茶具有饮用方便、相对体积(或质量)小、易保存运输、不含有害物质、含有传统茶叶中能够进入茶汤的营养成分和风味物质的特点，因此，近年来在国内外，特别是在欧美国家颇为流行，是一种很有前景的饮品[8]。速溶茶的加工方法主要有酶法和微波法等，应用较多的外源酶主要有纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等[9]。王元凤等[10]研究外源酶应用于速溶茶、茶饮料加工中，其目的是为了提高产品的冷溶性、产品得率或减少形成速溶茶粉末的泡沫。王登良等[11]研究表明纤维素酶处理茶叶后，水浸出物、多酚、水溶性糖、黄酮的含量均明显提高。目前，酶法辅助处理在芦笋叶速溶茶加工中的应用还未见报道。

本实验研究单独采用纤维素酶和中性蛋白酶以及这两种酶复合辅助处理芦笋叶速溶茶的新工艺，并对复合酶的较佳工艺条件进行优化，拟为芦笋叶速溶茶的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

FZ102微型植物试样粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；UV-2100型紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；Q/BKYY31-2000热风干燥箱 上海跃进医疗机械厂；SHB-Ⅱ循环水式多用真空泵、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市英裕予华仪器厂。

作者简介： 向泽琼，女，重庆丰都人，重庆市丰都县第一小学校，教师，本科学历，研究方向：中小学体育与德育。

1.2 仪器与设备

芦笋叶粉(水分含量9.1%，黄酮含量25.68‰) 自制；纤维素酶(最适温度50℃，最适pH4.8，酶活力2000U/mL，配成4U/mL酶液) 宁夏和氏璧生物技术有限公司；中性蛋白酶(最适温度50℃，最适pH7.0，酶活力1000AU/kg，配成0.002AU/mL酶液) Novo Nordisk公司；三氯化铝、二甲基四亚砜 国药集团上海化学试剂厂；茚三酮 天津科密欧化学试剂公司；乙酸锂上海风舜精细化工有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 芦笋叶速溶茶生产工艺

工艺流程：芦笋叶→杀青→粉碎过筛→酶法辅助处理→过滤→调配、增香→均质→真空浓缩→喷雾干燥→芦笋叶速溶茶。

操作要点：1)杀青：芦笋叶经210℃杀青处理后，30℃热风烘干；2)粉碎过筛：用微型植物粉碎机把烘干的芦笋叶粉碎，过60目筛；3)酶法辅助处理：称取0.5g芦笋叶粉，用20mL去离子水浸泡，加入纤维素酶或中性蛋白酶或二者的复合酶进行辅助处理。将中性蛋白酶酶解液在pH9.0条件下灭酶，测定黄酮提取率和氨基酸含量。纤维素酶解液在pH7.0条件下灭酶，测定黄酮提取率。

1.3.2 测定方法

水分：参照GB 5009.3—2010《食品安全国家标准：食品中水分的测定》中的直接干燥法；游离氨基酸含量：参照GB 8314—1987《茶：游离氨基酸总量测定》。

1.3.3 黄酮含量测定

采用三氯化铝比色法。精确称取样品2 g，加水80mL，于沸水浴中提取30min，过滤，加蒸馏水定容至100mL，摇匀。吸取试液0.5mL，加1%三氯化铝溶液定容至10mL，摇匀，静置10min后比色，用1cm比色皿，于波长420nm处测定吸光度。

有关资料显示，我国公众急救知识普及率不超过1%，其中，大学生接受急救培训的大多数为医学类的学生。欧美、日韩等国家大力推行应急救护培训，其中，美国公众基本急救技术普及率达89.95%，新加坡卫生救护知识培训普及率达20%。我国开展公众急救知识培训起步较晚，存在着实施及资金双重困难。在我国人口基数大、幅员辽阔的国情下，在不同区域和不同居民群体中进行急救知识的普及，也存在着许多不同的特性，我国居民急救能力的培养仍然面临着较大的挑战。

法拉利812 Superfast上下车的便利程度不亚于一辆普通的大众高尔夫，并且驾驶席侧车窗可在120公里/小时的车速下保持开启而不会产生刺耳的噪音。不仅如此，当前车速和挡位等信息还可以实时呈现在副驾驶的眼前，这无疑为驾驶员和副驾驶之间的交流提供了充分的素材。

1.3.4 单酶处理试验

在单酶试验的基础上进行复合酶正交试验，选用L9(34)正交表，考察：1)酶的总添加量1、1.5、2mL；2)酶解时间30、50、70min；3)复配比1:2、1:1、2:1(即加入纤维素酶、中性蛋白酶酶液的体积比)对黄酮提取率、氨基酸含量的影响。试验因素水平见表1。

1.3.5 复合酶处理试验

称取0.5g过60目筛芦笋叶粉，放入酶反应器中，进行：1)1mL(酶与底物比4AU/kg，下同)、1.5mL(6AU/kg)、2mL(8AU/kg)中性蛋白酶酶液分别在30、60、90、120、150min条件下浸提试验；2)1mL(8U/g)、1.5mL(12U/g)、2mL(16U/g)纤维素酶酶液分别在30、60、90、120、150min条件下浸提试验。

式中：320表示当吸光度等于1.0时，相当于320 μg黄酮；L1为定容体积/mL；L2为吸取试样体积/mL；M为试样质量/g；m为试样干基质量分数/%。

表1 复合酶处理正交试验因素水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

2 结果与分析

2.1 中性蛋白酶对芦笋叶浸提效果的影响

图1 中性蛋白酶对芦笋叶黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of neutral protease amount on the extraction yield of flavonoids from asparagus leaves

试验中有两个指标，根据各个指标的重要程度，采用综合评分法[15]得出试验的总指标，再根据这个指标对试验结果作进一步分析。黄酮提取率、氨基酸含量值可直接转化为数量指标。根据实际要求，黄酮提取率、氨基酸含量的权重分别取0.8和0.2，每次试验的综合分数=黄酮提取率×0.8+氨基酸含量×0.2。正交试验结果见表2，由极差分析的结果可知RB＞RA＞RC，因素从主到次的顺序为：B酶解时间、A酶添加量、C复配比，优方案定为A3B2C3。

2017年七月，全国金融会议召开，会议提出了“服务实体经济，防控金融风险，深化金融改革”的金融改革目标。针对当前资本市场资本“空转”，民营经济和普通群众杠杆日益增加的现状，提出了包括“一行三会”在内的监管主体参与及制度方式，控制资本的肆意流动，降低经济“杠杆率”，规避债务风险。引“货币”、“资本”之水入实体经济，引导金融回归服务实体经济的本质。

图2 中性蛋白酶对芦笋叶提取液中氨基酸含量的影响Fig.2 Effect of neutral protease amount on the amino acid content of asparagus instant tea

由图2可知，当酶与底物比在4～6AU/kg之间时，随着酶与底物比的增加，氨基酸含量增加明显；当酶与底物比在6～8AU/kg之间时，随着酶与底物比的增加，氨基酸含量增幅减缓。由图2还可看出，随着时间增加，氨基酸含量迅速增加，到90min时达到最高，然后增幅趋于平缓。芦笋叶中蛋白质大部分是不可溶的，中性蛋白酶可将蛋白质水解为氨基酸。综合考虑，选择中性蛋白酶浸提时的酶与底物比和时间分别为6AU/kg和 60～90min。

2.2 纤维素酶对芦笋叶浸提效果的影响

图3 纤维素酶对芦笋叶黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of cellulose amount on the extraction rate of flavonoids from asparagus leaves

由图3可以看出，当酶与底物比在8U/g到12U/g之间时，随着酶与底物比的增加，黄酮提取率增加明显；当酶与底物比在12U/g到16U/g之间时，随着酶与底物比的增加，黄酮提取率反而下降。芦笋叶细胞壁上的纤维素受到纤维素酶的作用发生降解，胞内有效成分容易浸出进入提取液中，利于黄酮浸出，但过高的酶与底物比对纤维素酶的水解作用产生抑制，使酶的活力降低[11-14]。从图3还可以看出，在30～90min之间，黄酮提取率稍有增加，当时间大于90min时，黄酮提取率稍有下降，可能是芦笋叶提取液中的黄酮与氧气接触而被破坏。因此，选择纤维素酶浸提时的酶与底物比和酶解时间为分别12U/g和30～60min。

2.3 复合酶作用对芦笋叶浸提效果的影响

由图1可知，当酶与底物比在4～6AU/kg之间时，随着酶与底物比的增加，黄酮提取率增加明显；当酶与底物比在6～8AU/kg之间时，随着酶与底物比的增加，黄酮提取率迅速下降。虽然酶与底物比的增加一定程度上可以提高黄酮提取率，但蛋白酶本身也是一种蛋白质，容易与茶多酚类物质发生络合及沉淀作用，过高的酶与底物比促进沉淀的产生影响酶的活力，不利于黄酮的提取[12-14]。由图1还可看出，随着时间延长，黄酮提取率先增后减，在时间60min时最高。由于在液固相传质没有达到相平衡时，浸提时间越长，越能保证浸提时固相向液相传质，可以提高提取率。但随着时间延长，氧气会导致黄酮氧化，液相中黄酮含量减少，黄酮提取率有所降低。

表2 复合酶处理正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design arrangement and experimental results

表3数据显示，酶添加量和时间对综合评分结果影响显著，复配比的影响不显著。综合考虑，确定复合酶辅助浸提芦笋叶速溶茶较佳的工艺条件为纤维素酶和中性蛋白酶酶的总添加量2mL、时间50min、复配比2:1，即纤维素酶和中性蛋白酶体积分别为1.32mL和0.66mL，可知此时酶与底物比为10.56U/g和2.64AU/kg。

二是，引入“中国梦”宣传教育可以提高大学生的历史责任感〔3〕。现阶段，随着人们生活水平的提高，部分大学生已经养成了浪费的习惯，且缺乏历史责任感，不能正确认识自身肩上所承担的历史责任。面对此种情况，各个大学就需要积极引入“中国梦”宣传教育，通过此项工作，让大学生可以正式自身历史使命，主动承担民族建设责任，从而为“中国梦”的实现贡献出自身力量。

表3 正交试验结果的方差分析Table 3 Variance analysis for the weighted average of the extraction yield of flavonoids from asparagus leaves and the amino acid content of asparagus instant tea with various extraction conditions

2.4 优化条件的验证实验

为了检验结果的准确性，根据以上数据处理结果进行了验证实验和空白试验，即在纤维素酶与底物比10.56U/g、中性蛋白酶酶与底物比2.64AU/kg、酶解时间50min条件下进行验证实验，重复3次取平均值，验证实验结果见表4，空白试验不加酶液(其他条件同上)进行试验。

表4 验证实验结果Table 4 Verification of optimized conditions for asparagus instant tea extraction

在此工艺条件下浸提芦笋叶，黄酮提取率为95.8%，提取液中氨基酸含量为20.1mg/g，空白试验结果为黄酮提取率为78.9%，提取液中氨基酸含量为17.3mg/g。优化条件下，黄酮提取率和提取液中氨基酸含量分别是空白试验对照组的121%和116%倍。由单因素试验可知，中性蛋白酶浸提时加酶量和时间分别为6AU/kg、60～90min，黄酮提取率91%～93%，纤维素酶浸提时加酶量和时间为分别12U/g和30～60min，黄酮提取率93%～95%，复合酶处理时纤维素酶酶与中性蛋白酶底物比分别10.56 U/g、2.64AU/kg，时间50min，黄酮提取率为95.8%。由此可知为达相同提取效果，复合酶处理比单一酶作用时酶用量减少，作用时间短，浸提效率高，可节省提取成本。

长期慢性压力必然引起脑卒中病人家庭照顾者知觉压力提高。本次调查结果表明：脑卒中病人家庭照顾者知觉压力处于较高水平，且得分高于国内常模，差异有统计学意义(P<0.05)。表3和表4结果显示：知觉压力水平较高者，承受的压力较大，心理健康水平较低。

3 结 论

在单因素试验的基础上，以黄酮提取率、氨基酸含量为指标，采用综合评分法进行正交试验设计，正交试验确定的复合酶辅助浸提的较佳工艺条件为：纤维素酶酶与底物比10.56U/g、中性蛋白酶酶与底物比2.64AU/kg、时间50min。在该工艺条件下浸提芦笋叶，黄酮提取率为95.8%，提取液中氨基酸含量为20.1mg/g，黄酮提取率和提取液中氨基酸含量分别是空白试验对照组的121%和116%倍。同时表明酶复合作用时可节省酶量、缩短时间，从而提高芦笋叶速溶茶浸提效率。

[1] 张秀昌, 张爱莉. 芦笋产业发展存在的问题及对策[J]. 河北农业科技, 2008(6):5-6.

[2] DELI J, MATUS Z, TOTH G. Carotenoid composition in the fruits ofAsparagus offidnalls[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000, 48(7):2793-2796.

[3] WANG Mingfu, TADMOR Y, WU Qingli, et al. Quantification of protodioscin and rutin in asparagus shoots by LC/MS and HPLC methods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(21):6132-6136.

[4] 张素华, 夏秋艳, 朱强. 芦笋营养成分分析与加工品质改善的研究[J]. 食品工业科技, 2002, 23(6):16-18.

[5] 李华, 张子德, 刘孟纯, 等. 不同浓度6-BA处理对鲜切绿芦笋保鲜效果的影响[J]. 保鲜与加工, 2008, 8(1):16-19.

[6] 宋贤聚, 张愍, 桂晓琦. 芦笋复合果蔬汁稳定性的研究[J]. 食品与生物技术学报, 2007, 26(6):21-24.

[7] 鲍彤华, 张露, 张全正. 芦笋罐头下脚料制作营养浊汁饮料的工艺研究[J]. 食品工业科技, 2006(10):120-123.

[8] 赵贵红. 营养型芦笋醋饮料的研制[J]. 中国酿造, 2008, 178(1):80-81.

[9] 康孟利, 薛旭初, 骆耀平, 等. 速溶茶研究进展及前景[J]. 茶叶, 2006,32(3):136-140.

[10] 王元凤, 王登良, 魏新林. 酶技术在茶叶深加工中的应用研究[J]. 饮料工业, 2000, 3(6):18-22.

[11] 王登良, 王盈峰, 严玉琴. 苦丁茶酶解浸提方法的研究[J]. 茶叶科学,2004, 24(4):295-301.

[12] NINDO C I, SUNB T, WANG S W, et al. Evaluation of drying technologies for retention of physical quality and antioxidants in asparagus(Asparagus officinalisL.)[J]. Lebensm Wiss u Technol, 2003, 36(5):507-516.

[13] MAKRIS D P, ROSSITER J T. Domestic processing of onion bulbs(Allium cepa)and asparagus spears (Asparagus officinalis):Effect on flavonol content and antioxidant status[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(7):3216-3222.

[14] 谭平, 廖晓科. 复合酶对绿茶饮料质量影响的研究[J]. 食品和机械,2005, 21(2):63-65.

[15] 李云雁, 胡传荣. 试验设计与数据处理[M]. 北京:化学工业出版社,2005:87-92.

Enzymatic Extraction Technology of Asparagus Instant Tea

CAI Guang-xia1，CHEN Ji-wang1,*，WANG Yuan-feng2，WEI Xin-lin2
(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

TS272.4

A

1002-6630(2010)18-0018-04

2009-11-11

国家“863”计划项目(2008AA10Z322)；上海崇明生态岛建设重大科技专项(07DZ12043)；上海市科技启明星项目(07QB14047)

蔡广霞(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为果蔬深加工机理及工程化。E-mail：caiguangxia@126.com

*通信作者：陈季旺(1971—)，男，副教授，博士，研究方向为果蔬深加工机理及工程化。E-mail：jiwangchen@yahoo.com.cn