天然促生长因子促进益生菌发酵牛骨粉钙转化的工艺优化

吴 敏，罗爱平*，尹彦洋，刘芝泽

(1.铜仁职业技术学院计算机应用系，贵州 铜仁 554300；2.贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

天然促生长因子促进益生菌发酵牛骨粉钙转化的工艺优化

吴 敏1，罗爱平2,*，尹彦洋2，刘芝泽2

(1.铜仁职业技术学院计算机应用系，贵州 铜仁 554300；2.贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

利用益生菌发酵牛骨粉，添加8种天然益生菌促生长因子协同发酵牛骨粉。通过单因素试验，筛选益生菌促生长因子。采用L9(34)正交试验设计，以游离钙转化率为特征性指标，优化几种天然促生长因子的最佳组合。单因素试验结果表明：玉米汁、番茄汁、豆芽汁、白菜汁、胡萝卜汁、牛奶均对益生菌有促生长作用，除玉米汁外，发酵终止时的pH值越低、活菌数越大，钙转化率越高。白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶最适添加量均为15%，胡萝卜汁为20%，玉米汁为5%。马铃薯汁对鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌及两者协同发酵时均有抑制作用。正交试验结果表明：番茄汁、豆芽汁、白菜汁、胡萝卜汁4种促生长因子协同发酵牛骨粉钙转化率的最优组合为：白菜汁18.0%、豆芽汁15.0%、番茄汁12.0%、胡萝卜汁20.0%，在该条件下钙转化率可达38.8%。

益生菌；牛骨粉；促生长因子；钙转化率

Abstract：Natural growth-promoting factors were added to probiotic fermentation of fresh cattle bone meal for exploring the synergistic effect on the conversion rate of calcium. Single factor experiments were used to select probiotics. Meanwhile,orthogonal experiments were used to explore the optimal combination of growth factors on the basis of conversion rate of free calcium. Results indicated that corn juice, tomato juice, bean sprout juice, cabbage juice, carrot juice and milk have obvious growth-promoting effect on probiotics. Except for corn juice, the lower pH at the end of fermentation could result in the greater number of viable cells and the higher conversion rate of calcium. In addition, the optimal addition amount of cabbage juice, tomato juice, bean sprout juice and milk was 15%, whereas 20% for carrot juice and 5% for corn juice. Potato juice exhibited an inhibitory effect on the fermentation ofLactobacillus rhamnosus,Lactobacillus acidophilus, and their combinatorial fermentation.Orthogonal experimental results showed that the optimal combinatorial formula of four growth-promoting factors were 18.0%cabbage juices, 15.0% bean sprout juice, 12.0% tomato juice and 20.0% carrot juice. The conversion rate of calcium was up to 38.8% at the condition of this optimal combinatorial formula.

Key words：probiotics；bovine bone meal；growth-promoting factor；conversion rate of calcium

利用益生菌发酵含适宜钙磷比(2:1)的牛骨粉[1]，不仅由于乳酸菌代谢产生的酸使结合态的钙转变为游离态[2]，而且水解牛骨蛋白，提供了辅助钙吸收的氨基酸和磷[3]。由于益生菌的不完全蛋白分解酶系，其生长所需的低氧化还原电势及对微量元素的需求，一般发酵液很难满足，导致发酵效率偏低[4-5]。天然促生长因子，如白菜汁、胡萝卜汁、番茄汁、豆芽汁等含有益生菌生长所必需的氨基酸和蛋白质，同时还含有益生菌生长所需的维生素和微量元素，可促进益生菌生长繁殖，提高其发酵效率[6]。

本研究在益生菌发酵牛骨粉实验基础上，通过添加制作简便、来源丰富、成本低、增殖明显的天然益生菌促生长因子，提高产品中益生菌的活菌数与钙转化率。通过对益生菌增殖因子的筛选，确定促生长因子的添加量，优化促生长因子的组合。进一步将补钙剂与促进钙吸收利用的微生态调节剂有机地结合在一起。为开发生物态补钙制剂提供理论依据和技术参数。

1 材料与方法

1.1 材料

牛骨粉由贵州大学生命科学学院食品营养与安全系提供；雪花牌啤酒，购于贵阳花溪佳宇超市。

1.2 仪器与设备

HI208磁力搅拌多用综合酸度测定仪 北京哈纳科仪科技有限公司；LDZM-50立式压力蒸汽灭菌器 上海长城仪表厂；SHZ-82气浴恒温振荡器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；SHP-250型智能生化培养箱 上海兴都仪器设备有限公司。

①项目区的划定主要是以乡镇为基本范围，但不限于按乡镇划分。根据规划投资控制规模，统筹考虑各级政府资金配套、资金整合和资金筹措能力，遵循“相对集中、地方自愿、公开公正”的原则合理选择项目区。

1.3 菌种与培养基

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus，LGG)，菌种编号1.2466；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，LA)，菌种编号1.1854；均购于中国科学院微生物研究所。

鼠李糖乳杆菌与嗜酸乳杆菌活化培养基均为MRS培养基(未添加碳酸钙)。

1.4 方法

1.4.1 菌种活化

将菌种进行活化复壮，测其活菌数[7]。以24h内达到对数生长期(活菌数＞106CFU/mL)为止。

1.4.2 菌种扩大培养

菌种活化后，以3%的比例接种于种子液，37℃100r/min 振荡培养，测其活菌数，以24h内达到对数生长期(活菌数＞ 106CFU/mL)为止[8]。

1.4.3 牛骨粉发酵液制备

按质量浓度骨粉5g/100mL、葡萄糖11g/100mL、双蒸水84%，pH6.2制备牛骨粉发酵液[8]。

1.4.4 天然促生长因子的筛选

1.4.4.1 天然促生长因子的制备

豆芽汁：豆芽500g洗净，加少量蒸馏水制浆，煮沸15min，四层纱布过滤，加水调节滤液的质量，使豆芽与滤液的比例1:1.5(m/V)，再将滤液2500r/min离心10min，除去固体杂质，取上清液，置－15℃备用；白菜汁、番茄汁、马铃薯汁、胡萝卜汁和玉米汁制备方法与豆芽汁相同；牛奶经脱脂处理后置－15℃备用。

促生长因子的初步筛选：在MRS培养基中分别添加体积分数10%的豆芽汁、白菜汁、番茄汁、马铃薯汁、胡萝卜汁、玉米汁、牛奶和啤酒，发酵20h，同时做空白实验，以活菌数为特征性指标，筛选促LGG、LA生长因子。

促生长因子的确定：采用单因素试验设计。将初步筛选的促生长因子分别按体积分数5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、25.0%的用量添加到发酵液中，以接种量3%，菌种LGG:LA为4.67:1(m/m)，37℃、100r/min振荡培养69.96h[7]以钙转化率为评定指标，筛选出具有明显促进钙转化的促生长因子及添加量。

1.4.5 天然促生长因子促进益生菌发酵牛骨粉的工艺优化

在单因素试验的基础上，选取影响钙转化率较为明显的4种促生长因子，采用L9(34)正交试验，以钙转化率为评定指标，对4种促生长因子协同发酵牛骨粉条件进行优化。

1.4.6 测定指标

1.4.6.1 骨粉中水分测定

按照GB/T 9695.15—2008《肉与肉制品水分含量测定》中的直接干燥法测定。

1.4.6.2 钙转化率测定

钙含量测定：采用GB/T 9695.13—2009《肉与肉制品钙含量测定》中的高锰酸钾滴定法测定。

1.4.6.3 pH值测定

在(25.0±0.5)℃条件下，采用HI208磁力搅拌多用综合酸度测定仪测定各发酵液pH值。

1.4.6.4 活菌数测定

按照GB/T 4789.35—2008《食品卫生微生物学检验乳酸菌饮料中乳酸菌检验》中的平板倾注法测定。

1.5 数据处理

采用SPSS 12.0统计分析软件进行显著性分析，用Origin 7.0软件绘制图形，每个指标重复测定3次。

2 结果与分析

2.1 骨粉成分测定结果

随机取样平行测定，测得本实验中所制备的原料牛骨粉的平均含水率为7.63%；平均钙含量为2.05×104mg/100g。

表1 不同促生长因子对益生菌活菌数的影响Table 1 Effects of growth-promoting factors on the number of viable probiotics CFU/mL

2.2 促生长因子对益生菌生长的影响

2.2.1 促生长因子筛选实验

据报道[10-15]，豆芽汁、白菜汁、番茄汁、马铃薯汁、胡萝卜汁、玉米汁、牛奶和啤酒等有促进乳酸菌生长的作用，选择这8种天然营养物质作为促进益生菌生长因子。不同促生长因子促进益生菌生长情况见表1。

由表1可知，LGG组：白菜汁、豆芽汁、番茄汁、胡萝卜汁活菌数分别为3.22×1011、1.45×1011、37.2×1011、19.8×1011CFU/mL，均明显高于空白组0.58×1011CFU/mL，表明其对LGG生长有明显促进作用；牛奶、玉米汁活菌数与空白组无显著性差异，即牛奶、玉米汁对LGG的促生长效果不显著。马铃薯汁、啤酒活菌数均低于空白组，表明其对LGG的生长有抑制作用。白菜汁、豆芽汁、番茄汁、胡萝卜汁对LG G的促生长效果大小为：番茄汁＞胡萝卜汁＞白菜汁＞豆芽汁。

LA组：白菜汁、番茄汁、胡萝卜汁、啤酒、玉米汁活菌数分别为12.29×109、7.78×109、13.13×109、2.01×109、2.02×109CFU/mL均明显高于空白组1.15×109CFU/mL，表明它们促LA生长效果明显。牛奶、豆芽汁活菌数与空白组无显著性差异，即牛奶与豆芽汁对LA的促生长效果不明显。马铃薯汁活菌数低于空白组，表明其对LA生长有抑制作用。不同促生长因子对LA的促生效果大小为：胡萝卜汁＞白菜汁＞番茄汁＞啤酒≈玉米。

LGG:LA组：白菜汁、豆芽汁、番茄汁、胡萝卜汁活菌数分别为5.82×1010、2.43×1010、4.36×1010、3.39×1010CFU/mL均明显高于空白组0.88×1010CFU/mL，均能促进LGG与LA共生。牛奶、啤酒、玉米汁活菌数与空白组无显著性差异，即牛奶对LGG与LA共同生长无明显的促进作用。马铃薯汁活菌数低于空白组，表明其对LGG与LA生长有抑制作用。白菜汁、豆芽汁、番茄汁、胡萝卜汁4种促LGG与LA共生作用的效果为：白菜汁＞番茄汁＞胡萝卜汁＞豆芽汁。

综上所述，马铃薯对LGG、LA及LGG＋LA均有抑制作用，其机理有待进一步研究。根据8个促生长因子对LGG与LA促生长效果的大小，并与空白组比较，舍去啤酒与马铃薯汁两种对益生菌无明显促生长效果或有抑制作用的因子，对其余6个促生长因子进一步筛选。

2.2.2 单因素试验结果

不同促生长因子中钙含量有所差异，为排除其对试验结果产生的影响，对各促生长因子中钙含量进行测定，结果见表2。再进行单因素试验设计，结果见表3。

表2 各促生长因子中的钙含量Table 2 Calcium contents of growth-promoting factors

表3 单因素试验主要测定指标结果Table 3 Effects of type and amount of added growth-promoting factors on conversion rate of calcium

由表3可知，白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶添加量在5.0%～15.0%时，钙转化率随白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶添加量的增大而升高，添加量为15.0%时达最大值，分别为31.75%、31.75%、30.48%、24.13%，比最小值分别提高13.64%、19.05%、20.00%、15.23%。添加量在15%～25%时，钙转化率随添加量的增大而降低；胡萝卜汁添加量在5.0%～20.0%时，钙转化率随胡萝卜汁添加量的增大而升高，添加量为20.0%时达最大值33.34%，比最小值26.94%，提高23.76%。胡萝卜汁添加量在20.0%～25.0%时，钙转化率随胡萝卜汁添加量的增大而降低；随玉米汁添加量的增大，钙转化率降低。添加量为5.0%时达29.21%，比最小值提高29.59%。结果表明，玉米汁的添加量与钙转化率成反比。

综上所述：适量浓度的白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶、胡萝卜汁有利于益生菌生长，有助于骨粉中钙转化率提高。

如表3所示，添加量过大也会抑制益生菌的生长，降低钙转化率。结果表明：白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶添加量为15.0%为宜。胡萝卜汁添加量20.0%为宜。

单因素试验结果表明：白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶最适添加量均为15%，胡萝卜汁为20%，玉米为5%。除玉米汁试验组外，pH值越低、活菌数越大，钙转化率越高。用SPSS 12.0软件对不同促生长因子pH值、活菌数和钙转化率进行相关性分析，得出pH值、活菌数与钙转化率之间无显著(P＞0.05)的相关性。

2.3 益生菌发酵正交试验

为进一步提高钙转化率，选取胡萝卜汁、番茄汁、豆芽汁和白菜汁4种促钙转化效果明显的促生长因子为因素，采用L9(34)正交试验设计，以钙转化率为指标评价4种促生因子协同作用对益生菌发酵牛骨粉钙转化率的影响。

表4 L9(34)正交试验结果与分析Table 4 Orthogonal array design layout and experimental results

由表5中极差分析可知，4个因素对钙转化率的影响次序是：C＞B＞A＞D，即番茄汁＞豆芽汁＞白菜汁＞胡萝卜汁。最优组合为A3B2C1D2，即白菜汁18.0%、豆芽汁15.0%、番茄汁12.0%、胡萝卜汁20.0%。经验证性实验结果显示钙转化率为38.8%。此结果与第8组试验组A3B2C1D3钙转化率达最大值38.1%的结果极为相近，相对偏差仅1.84%，只影响效果最小的D因素不同，表明试验的最佳理论组与实际相符合，结果可靠。

4 结 论

4.1 豆芽汁、白菜汁、番茄汁、马铃薯汁、胡萝卜汁、玉米汁、牛奶、啤酒8种对LGG的促生效果大小为：番茄汁＞胡萝卜汁＞白菜汁＞豆芽汁＞空白牛奶，玉米汁、啤酒对LGG的促生长效果不明显；对LA的促生长效果大小为：胡萝卜汁＞白菜汁＞番茄汁＞啤酒、玉米汁＞空白，牛奶、豆芽汁对LA的促生长效果不明显；对LGG＋LA的促生长效果大小为：白菜汁＞番茄汁＞胡萝卜汁＞豆芽汁＞空白，牛奶、玉米汁、啤酒对LGG＋LA的促生效果不明显。而马铃薯对LGG、LA及LGG＋LA均有抑制作用，其机理有待进一步研究。

4.2 单因素试验结果表明，白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶最适添加量均为15%，胡萝卜汁为20%，玉米汁为5%。除玉米汁外，发酵终止时的pH值越低、活菌数越大，钙转化率越高。

4.3 正交试验结果表明，4种促生长因子协同发酵牛骨粉钙转化率影响主次因素为番茄汁＞豆芽汁＞白菜汁＞胡萝卜汁。最优组合为白菜汁18.0%、豆芽汁15.0%、番茄汁12.0%、胡萝卜汁20.0%、钙转化率可达38.8%。

4.4 天然促生长因子的原料如豆芽、白菜、番茄、马铃薯、胡萝卜、玉米等因采收季节、地域、品种不同，营养成分含量有所差异，如何保证其对益生菌的促生长效果稳定有待进一步研究。

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Optimization of Amounts of Added Natural Growth-promoting Factors for Fermentation of Cattle Bone Meal by Probiotics for Calcium Conversion

WU Min1，LUO Ai-ping2,*，YIN Yan-yang2，LIU Zhi-ze2
(1. Department of Computer and Applications, Tongren Polytechnic, Tongren 554300, China；2. College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

TS251.2

A

1002-6630(2010)21-0222-04

2010-01-20

贵州省科技厅资助项目(黔科合NY字[2007]3021号)；贵州现代肉牛产业技术体系建设项目(GZCYTX-0301-03)

吴敏(1968—)，女，副教授，硕士，主要从事畜产品加工研究与开发。E-mail：trzywumin@163.com

*通信作者：罗爱平(1958—)，女，教授，本科，主要从事畜产品加工研究与开发。E-mail：luoaiping58@126.com