薄层层析-生物自显影法筛选油菜蜂花粉中活性成分

孙丽萍，杜 夏，徐 响，董 捷，安仲姚，杨佳林

(1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2.国家农产品加工技术研发中心蜂产品分中心，北京 100093)

薄层层析-生物自显影法筛选油菜蜂花粉中活性成分

孙丽萍1,2，杜 夏1，徐 响1,2，董 捷1,2，安仲姚1，杨佳林1

(1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2.国家农产品加工技术研发中心蜂产品分中心，北京 100093)

采用薄层层析-生物自显影法筛选油菜蜂花粉中清除DPPH自由基的活性成分和抑菌活性成分。结果显示：油菜蜂花粉中清除DPPH自由基的黄酮类活性成分主要以苷的形式存在，酸解后生成了包括槲皮素和山奈酚在内的多种抗氧化成分；在Rf值0.29和0.86处存在抑菌活性成分，不同显色方法确认，抑菌活性成分的种类可能包括酚类、鞣质、黄酮类或皂苷类。

油菜蜂花粉；薄层层析-生物自显影；抗氧化活性；抑菌活性

Abstract：TLC-bioautography was used to screen the DPPH radical scavengers and the antibacterial ingredients in rape bee pollen. The experimental results indicated the flavonoids as DPPH radical scavengers mainly existed in form of glycosides in rape bee pollen, and the acidicly hydrolyzed ethanol extract from rape bee pollen contained a variety of antioxidant compounds including quercetin and kaempferol. There were two small molecules with Rf values of 0.29 and 0.86 found to have antibacterial activity in the water extract from rape bee pollen. According to the results of color development reaction, the types of antibacterial components were polyphenols, tannin, flavonoids or saponins, etc.

Key words：rape bee pollen；TLC-bioautography；antioxidant activity；antibacterial activity

蜂花粉是自然界存在的营养最丰富的一种纯天然食品，含有蛋白质、酶类、不饱和脂肪酸、碳水化合物、酚类、黄酮类物质、磷脂、各种维生素和微量元素，蜂花粉被称为“天然微型营养库”[1]。蜂花粉中含有丰富的活性物质能被人体直接吸收利用，具有调节神经系统、软化心脑血管、延缓衰老、提高免疫功能、增强体力等功能，是一种药食同源食品[2]。研究表明油菜蜂花粉不但具有抗炎[3]、保护肝脏[4]、调节免疫[5]功能，还有抑菌[6]和抗氧化[7]功能。

薄层层析(TLC)是一种快速分离和鉴定混合物成分的方法，而薄层层析-生物自显影法(TLC-Bioautography)是近年来应用的一种将薄层层析和生物活性测定相结合的抗菌活性物质检测方法[8-11]。利用薄层色谱的分离能力将实验样品在薄层板上通过展开剂展开后，使薄层板与含有供试微生物的培养基相接触，在一定条件下培养一段时间后，非活性部位会被生长出的供试微生物所覆盖而呈现背景色；活性部位由于抗菌成分的存在，指示微生物的生长受到抑制而呈现抑菌斑点，这样就可以初步了解混合物抗菌活性成分的相对极性，为活性单体化合物的分离提供依据。TLC-DPPH是薄层层析-生物自显影法的一种，样品展开后使薄层板与DPPH相接触，具有清除DPPH自由基能力的物质能使DPPH还原成DPPH-H而呈现黄色，薄层板本身显紫色，从而筛选出活性组分[12]。薄层层析-生物自显影法具有简单、快捷、直观的特点，用以评价植物中生物活性物质的抗氧化能力及抑菌性[13-14]，在蜂花粉抗氧化和抑菌活性成分研究中应用较少。本实验采用薄层层析-生物自显影法筛选油菜蜂花粉中抗氧化及抑菌活性成分，研究蜂花粉抗氧化活性和抑菌活性的物质基础，为蜂花粉功效研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

油菜蜂花粉：产地：甘肃天水市，－20℃保藏。

DPPH、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、柚皮素Sigma公司；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，CICC编号10201) 中国微生物菌种保藏中心；LB琼脂培养基 北京路桥技术有限责任公司；硅胶G板 烟台市化学工业研究所；所用试剂均为分析纯。

AL204电子天平 梅特勒-托利多(上海)公司；SWGJ-1FD超净工作台 苏净集团安泰空气技术有限公司。

1.2 抗氧化活性组分筛选

1.2.1 样品制备

称取一定量破壁油菜蜂花粉[15]，加入10倍体积80%乙醇，超声提取两次，各1h，离心后合并上清，真空浓缩至干，记为乙醇提取物，备用；另取5.080g乙醇提取物，加入体积分数为25%盐酸溶液5mL，甲醇30mL，90℃回流1.5h，甲醇定容到100mL，记为酸解物，备用。

1.2.2 TLC-DPPH方法

取质量浓度为120μg/mL的槲皮素、山奈酚、异鼠李素、柚皮素各5μL，质量浓度为1mg/mL酸解物、醇提物各5μL，硅胶G板(10cm×10cm)点样，以苯、乙酸乙酯、甲酸体积比5:4:1为展开剂，展距8cm，展开后晾干，喷以0.04mg/mL的DPPH甲醇溶液，晾干观察。

1.3 抑菌活性组分筛选

1.3.1 样品制备

取适量破壁油菜蜂花粉[15]，加入5倍体积蒸馏水超声提取两次，各1h，合并上清液，减压浓缩后添加5倍体积无水乙醇，离心取上清液减压浓缩至干，备用。

1.3.2 TLC-自显影方法

花粉样品以乙酸乙酯、水、甲酸、乙酸体积比70:30:3:2为展开剂展开4份，其中一份喷施以0.04% DPPH溶液显色，另外3份利用生物自显影技术进行抑菌效果判定。取已进行金黄色葡萄球菌菌液涂布并干燥透的平皿，分别将已挥干溶剂并切为两部分的硅胶板平稳放置在琼脂表面(尽量避免产生气泡)，压实，一段时间后轻轻取下硅胶板，平皿37℃培养24h，以无细菌生长或细菌生长较少部位的Rf值判定有效抑菌成分所在。

2 结果与分析

2.1 抗氧化活性成分TLC-DPPH分析

以4种黄酮类化合物标准品(槲皮素、山奈酚、异鼠李素、柚皮素)和花粉醇提物酸解前后的样品进行TLC-DPPH实验，结果见图1。

图1 各样品对DPPH自由基清除作用的TLC图Fig.1 TLC-DPPH profiles of ethanol extract from rape bee pollen before and after acidic hydrolysis

如图1所示，槲皮素、山奈酚、异鼠李素和柚皮素具有不同程度的DPPH自由基清除活性，在相同质量浓度(120μg/mL)下，异鼠李素和柚皮素的斑点小而且暗，而槲皮素和山奈酚的斑点大而黄，说明槲皮素和山奈酚的DPPH清除效果要明显强于异鼠李素和柚皮素，斑点面积和明亮程度由大到小依次为槲皮素、山奈酚、柚皮素和异鼠李素，说明对于DPPH自由基的清除能力槲皮素＞山奈酚＞柚皮素＞异鼠李素。

酸解样品在Rf为0.6和0.74处有黄色斑点，与槲皮素和山奈酚、异鼠李素的Rf值相同，醇提样品在该位置不存在斑点，经HPLC检测Rf 0.74斑点的UV特征与山奈酚相同，说明油菜蜂花粉中存在以槲皮素和山奈酚为苷元的黄酮醇苷，经过水解后生成了槲皮素和山奈酚；而油菜蜂花粉中游离苷元的含量很少，在薄层板上无明显斑点。醇提物酸解前在Rf为0.26处有黄色斑点，酸解后消失，说明酸解后此物质完全分解，该成分鉴定工作正在进行中。醇提物Rf 值在0.2至0.8之间只有一个黄色斑点(Rf 0.26)，而酸解物有7个黄色斑点，说明花粉酸解后产生了更多种类的抗氧化成分。

2.2 抑菌活性成分TLC-生物自显影分析

将花粉水提醇沉组分进行TLC后贴板进行抑菌实验，结果见图2。

图2 TLC-生物自显影抑菌效果Fig.2 TLC-bioautography examination of fractions of water extract from rape bee pollen

TLC-自显影实验中，对硅胶板的贴板时间进行了考察，分别进行了贴板1、2、3h的预实验，实验结果显示，贴板1h抑菌物质无法完全扩散到琼脂中，生物自显影效果不明显，贴板2h和3h效果比较理想，所以实验时选择贴板2h。

如图2所示，薄层板与含有金黄色葡萄球菌培养基相接触，在37℃培养24h后，非活性部位会被生长出的金黄色葡萄球菌所覆盖而呈现背景色，活性部位(Rf为0.86和0.29处)由于抑菌成分的存在，金黄色葡萄球菌生长受到抑制而呈现抑菌斑点；花粉样品出现2个抑菌斑点，说明花粉中存在不止一种的抑菌活性成分；Rf 0.86的抑菌斑点大于Rf 0.29的抑菌斑点，说明该成分(Rf 0.86)的抑菌能力较强或是含量较大。经TLC-DPPH验证，Rf为0.86和0.29的两个抑菌斑点具有清除DPPH自由基的能力，说明两斑点成分具有抑菌和抗氧化双重活性。

经TLC不同显色方法确认，抑菌活性成分(Rf 0.86和Rf 0.29)对质量分数1% FeCl3、2% FeCl3-铁氰化钾、1% AlCl3和5% 磷钼酸显色剂呈阳性反应，说明抑菌活性成分可能是鞣质、酚类、黄酮类或皂苷类成分，分离鉴定工作正在进行中。

3 结 论

本研究将薄层层析-生物自显影法引入蜂花粉抗氧化活性和抑菌性研究中，采用TLC-DPPH法对油菜蜂花粉乙醇提取物及酸解物进行分析，结果表明，油菜蜂花粉中存在以槲皮素和山奈酚为苷元的黄酮醇苷，酸解后生成了槲皮素和山奈酚。DPPH自由基的清除能力槲皮素＞山奈酚＞柚皮素＞异鼠李素；用TLC-生物自显影技术筛选油菜蜂花粉抑菌活性组分，结果显示花粉水提醇沉部位存在两种抑菌成分，其Rf值为0.29和0.86，TLC-DPPH显示这两种成分还具有清除DPPH自由基的能力。实验证实薄层层析-生物自显影法能够简单、快捷、直观地显示出油菜蜂花粉中抗氧化及抑菌活性成分的相对极性，为活性单体化合物的分离提供依据。

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Using TLC-bioautography to Screen Active Compounds in Rape Bee Pollen

SUN Li-ping1,2，DU Xia1，XU Xiang1,2，DONG Jie1,2，AN Zhong-yao1，YANG Jia-lin1
(1. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. Bee Product Center, National R&D Center for Agro-Food Processing, Beijing 100093, China)

S896.4

A

1002-6630(2010)21-0069-03

2010-08-02

农业部公益性行业(农业)科研专项(nyhyzx07-041)；国家现代农业(蜂)产业技术体系建设专项(NYCYTX-43)；农业科技成果转化资金项目(2009GB23260456)

孙丽萍(1963—)，女，研究员，硕士，研究方向为蜂产品功能因子的分离纯化。E-mail：caasun@126.com