泥鳅肉酶解物对羟自由基的清除作用

姚东瑞，王淑军，李圆圆，盘赛昆，杨 帆,2

(1.淮海工学院食品工程学院，江苏 连云港 222005；2.大连海洋大学食品工程学院，辽宁 大连 116000)

泥鳅肉酶解物对羟自由基的清除作用

姚东瑞1，王淑军1，李圆圆1，盘赛昆1，杨 帆1,2

(1.淮海工学院食品工程学院，江苏 连云港 222005；2.大连海洋大学食品工程学院，辽宁 大连 116000)

为了探讨深度开发泥鳅蛋白制备功能性肽的可能性，采用比色法研究泥鳅肉酶解物对Fenton体系产生的羟自由基的清除效果，从复合风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶5种酶中，筛选出菠萝蛋白酶作为酶解泥鳅肉制备具有清除羟自由基活性酶解物的适宜水解酶。用响应面分析法(RSM)对该酶的酶解条件进行优化，并采用Sephadex G-15凝胶层析测定最佳酶解条件下制得的酶解液中活性肽的相对分子质量分布。结果表明，菠萝蛋白酶的最佳酶解条件为：固液比1:4、加酶量0.2%、pH6.47、温度54.48℃、酶解时间59.97min，酶解物对羟自由基的清除率为99.03 %，IC50值为0.57mg/mL。酶解液中活性肽的相对分子质量范围为1129～2344。

泥鳅肉；酶解物；羟自由基

Abstract：In order to obtain bioactive peptides having better ability to scavenge hydroxyl free radicals generated in Fenton system,the muscle of loach (Misgurnus anguillicaudatus) was hydrolyzed separately with flavourzyme, protamex, trypsin and pepsin and bromelain, and bromelain was the selected protease for the hydrolysis of loach muscle. The subsequent investigations involved optimization of the hydrolysis of loach muscle by response surface methodology for achieving maximum hydroxyl free radical scavenging rate and Sephadex G-15 gel column chromatographic determination of relative molecular mass distribution of the hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions. The optimal conditions for bromelain-catalyzed hydrolysis of loach muscle were determined as follows:solid/liquid ratio, 1:4; enzyme dose, 0.2%; pH, 6.47; hydrolysis temperature, 54.48 ℃; and hydrolysis duration, 59.97 ℃. The hydrolysate obtained under these conditions displayed a free radical scavenging rate of 99.03%and an IC50 value of 0.57 mg/mL, and contained peptides having a relative molecular mass varying from 1129 to 2344.

Key words：loach (Misgurnus anguillicaudatus)；enzymatic hydrolysis；hydroxyl free radical

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)是滋补佳品，素有“水中人参”的美誉。其肉质细嫩，营养价值较高，含有多种对人体有益的生物活性物质如蛋白质、多不饱和脂肪酸、赖氨酸等必需氨基酸、类胡萝卜素、尼克酸等维生素以及锌、硒等微量元素[1]。它们具有提高机体免疫活性的作用，对于人类防病治病、强身健体、延年益寿大有裨益，因此研究泥鳅肉中的活性成分具有实际应用价值。近10多年来，国内外对泥鳅中生物活性成分如凝集素[2]、泥鳅素(misgurin)[3]、超氧化物歧化酶[4]、泥鳅多糖[5]、牛磺酸[5]和透明质酸[6]的研究报道较多，但对泥鳅肉酶解物对羟自由基(·OH)清除作用的研究尚未见报道。

20世纪50年代中期Harman首先提出衰老自由基学说，该学说认为自由基攻击生命大分子造成组织损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤的恶性疾病的重大原因[7]，其中·OH是一种氧化能力很强的自由基，是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基[8]。

生物活性肽易被人体消化吸收，同时具有抗氧化、抗疲劳、调节激素和降血压等功能。抗氧化多肽是生物活性肽的一种，它具有通过减少氧自由基和羟自由基从而达到抗衰老的功能，因此含有生物活性肽的各种保健食品的开发具有广阔的市场前景。本实验采用Fenton体系测定泥鳅肉酶解物对·OH的清除作用，旨在为利用泥鳅肉蛋白制备抗氧化活性肽提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活泥鳅购于连云港敦尚镇泥鳅养殖基地，经淮海工学院水产养殖系程汉良教授鉴定为泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)，去头、尾和血并洗净，置于－40℃冰箱中冷冻备用。

复合蛋白酶(42300U/g)、复合风味蛋白酶(31800 U/g)诺维信(沈阳)公司；菠萝蛋白酶(43600U/g)、胰蛋白酶(41000U/g)、胃蛋白酶(28000U/g) 广州市齐云生物技术有限公司；α-脱氧核糖(2-Deoxy-D-ribose)、硫代巴比妥酸(TBA) 生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 仪器与设备

BS323S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；DKZ-3型电热恒温振荡水槽 上海一恒科技有限公司；日立CR22G高速冷冻离心机 日本Hitach公司；SynergyTM HT型多功能酶标仪 美国Bio-Tek公司；BioLogic DuoFlowTM层析系统 美国Bio-Rad公司；PHS-3C型pH计 上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工艺流程

鲜活泥鳅→预处理→冷冻备用→解冻→加水搅打均匀→酶解→灭酶(沸水浴，10min)→冷却→10000r/min离心20min→收集上清液

1.3.2 酶活力测定

采用Folin-酚法，以酪蛋白为底物，参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》[9]进行测定。

1.3.3 水解度测定

式中：CN为水解液中游离氨基氮的含量/(g/100mL)；CN0为鱼糜液水解前游离氨基氮的含量/(g/100mL)；C为鱼糜液中蛋白氮的含量/(g/100mL)。

游离氨基氮采用甲醛电位滴定法测定[10]，蛋白氮采用微量凯氏定氮法测定[11]。

1.3.4 对羟自由基清除作用实验

[12-13]测定泥鳅肉酶解物对Fenton体系产生的羟自由基清除率。IC50定义为清除50%羟自由基时的多肽质量浓度(mg/mL)，用SPSS13.0 统计软件的概率单位法(probit)计算。多肽含量测定采用Lowry法[14]。

1.3.5 酶的筛选

取泥鳅肉10g，加水30mL，以0.29%加酶量(m酶/m泥)分别加入菠萝蛋白酶(pH 7.0，50℃)、复合蛋白酶(pH7.0，50℃)、胰蛋白酶(pH8.0，55℃)、复合风味蛋白酶(pH7.0，50℃)和胃蛋白酶(pH2.0，37℃)，再分别在上述酶的适宜pH值和温度下进行酶解实验，以IC50及水解度为指标考察0～240min内(间隔30min)供试酶酶解液对羟自由基的清除效果及水解进程。

1.3.6 泥鳅肉酶解物的相对分子质量分布测定

酶解物相对分子质量分布的测定采用凝胶层析法[15]。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

图1 5种供试酶对泥鳅肉的水解进程Fig.1 Hydrolysis courses of loach muscle with five proteases

图2 不同蛋白酶酶解物对清除羟自由基的影响Fig.2 Change in IC50of loach muscle hydrolysate during hydrolysis with five proteases

如图1所示，随着时间延长，不同蛋白酶作用下的水解度逐渐增加，但增加趋势变缓和。图2显示，未经酶解的泥鳅肉匀浆具有一定清除羟自由基的能力，其清除率达45.7%，IC50为2.32mg/mL。除了胰蛋白酶外，供试的4种酶酶解物对羟自由基的清除能力均较未经酶解的匀浆有显著提高，但不同蛋白酶酶解物的清除作用存在一定差异，没有一定的规律性，并且水解度和清除率之间没有相关性，因此酶的选择及工艺条件的优化在制备功能肽时是非常必要的。菠萝蛋白酶和胃蛋白酶酶解物对羟自由基清除活性较高，但菠萝蛋白酶能在较短的时间内即可达到较好的效果，而胃蛋白酶达到相当的效果则需要较长的水解时间，因此选用菠萝蛋白酶用于下一阶段的研究。

2.2 单因素试验

2.2.1 固液比对酶解物清除羟自由基的影响

选取固液比1:3、1:4、1:5、1:6，调节pH7.0，加酶量为0.29%，在50℃下酶解60min，测定酶解液水解度及其对羟自由基的清除率，结果如图3所示。

图3 固液比对清除羟自由基的影响Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

从图3可知，在固液比为1:4时，水解度及酶解物对羟自由基的清除率同时达到最高，随着固液比的增大，底物浓度变小，水解度及清除率均呈下降趋势，因此，固液比为1:4是比较适宜的。

2.2.2 加酶量对酶解物清除羟自由基的影响

固液比1:4，加酶量为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，其他条件同2.2.1节，测定酶解液水解度及其对羟自由基的清除率，结果如图4所示。

图4 加酶量对清除羟自由基的影响Fig.4 Effect of enzyme dose on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

从图4可以看出，底物浓度保持不变，加酶量为0.2%时，酶解物对羟自由基的清除率最高，之后随着酶使用量的增加，清除率呈现下降趋势，并逐渐保持平稳，DH最大时清除率并非最大。

2.2.3 pH值对酶解物清除羟自由基的影响

固液比1:4，调节pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他条件同2.2.1节，测定酶解液水解度及其对羟自由基的清除率，结果如图5所示。

图5 pH值对清除羟自由基的影响Fig.5 Effect of pH on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

由图5可见，在pH6.5时，酶解物对羟自由基的清除能力最强，当pH值超过6.5时，酶解物对羟自由基的清除能力明显下降，而水解度在pH7.0时达到最大，这说明在相同的作用时间下，酶活力最强时水解得到的肽不一定具有活性肽的结构。

2.2.4 温度对酶解物清除羟自由基的影响

固液比1:4，分别选取酶解温度45、50、55、60、65℃，其他条件同2.2.1节，测定酶解液水解度及其对羟自由基的清除率，结果如图6所示。

图6 酶解温度对清除羟自由基的影响Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

由图6可见，酶解物对羟自由基的清除率随温度升高逐渐增大，在温度为50℃时达到最高值，因此选择最适酶解温度为50℃，继续提高温度，清除率下降较快。这是因为高于酶作用的温度范围后，酶的性质受到影响，从而影响酶解物对羟自由基的清除作用。

2.2.5 酶解时间对清除羟自由基的影响

固液比1:4，分别选取酶解时间30、45、60、75、90min，其他条件同2.2.1节，测定酶解液水解度及其对羟自由基的清除率，结果如图7所示。

由图7可知，酶解时间为60min时，酶解物显示出最强的羟自由基清除作用。随着时间延长，虽然水解度有所提高，但酶解物清除自由基的能力却明显下降。单因素试验结果显示，水解度与酶解物清除自由基的能力之间并没有显著的一致性规律。这可能是因为酶解物对羟自由的基清除作用主要取决于肽链中暴露的氨基酸侧链基团的性质和肽的氨基酸序列，而与水解程度无直接相关性[16]。

图7 酶解时间对清除羟自由基的影响Fig.7 Effect of hydrolysis duration on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

2.3 优化分析试验

2.3.1 响应面分析方案及结果

据单因素试验结果，通过SPSS V13.0软件分析作单因素方差分析，结果表明温度、时间、pH值三个因素对清除率有显著影响。利用Design-Expert 6.0.10.Trial软件，根据中心组合试验设计原理，设计三因素三水平共20个试验的响应面分析试验，泥鳅肉酶解物清除羟自由基试验设计方案与试验结果见表1。

表1 响应面试验设计与结果Table 1 Response surface design arrangement and experimental results

对表1试验数据进行多元线性回归拟合，对模型进行方差分析及显著性检验，采用手动优化的方法对设计进行优化，去掉对结果影响不显著的项，结果见表2。

从表2可以看出，模型及失拟项的P值分别为0.0001和0.1110，表明该模型拟合良好。其中温度和pH值对响应值有显著的交互作用，温度和时间的交互作用次之。

表2 响应面试验结果分析表Table 2 Analysis of variance for fitted regression model

2.3.2 羟自由基清除率的响应面分析

图8 时间、温度交互作用对清除率影响的等高线图和响应曲面图Fig.8 Response surface and contour plots revealing the interactive effects of hydrolysis temperature and duration on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

由图8可见，当pH值和酶解时间不变时，随着酶解温度的升高，自由基清除率升高，增幅比较显著，增加到一定程度后，变化不太明显；当pH值和酶解温度不变时，自由基清除率随着酶解时间的增加而升高，当时间增加到一定程度时，自由基清除率基本上趋于平稳。

由图9可见，当pH值和酶解时间不变时，随着酶解温度的升高，自由基清除率升高，增幅比较显著，增加到一定程度后，基本上趋于平稳；当酶解时间和酶解温度不变时，自由基清除率随着pH值的升高而升高，且在pH值比较低时增幅比较显著，随着pH值进一步提高，清除率逐渐下降。

图9 pH值、温度交互作用对清除率影响的等高线图和响应曲面图Fig.9 Response surface and contour plots revealing the interactive effects of hydrolysis temperature and pH on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

2.3.3 最佳酶解工艺验证

经软件优化后得到酶解的最佳条件为：酶解温度54.48℃、酶解时间59.97min、pH6.47、固液比1:4、加酶量0.2%，清除率预测值为99.52%。在该条件下重复3次实验，测得的羟自由基清除率均值为(99.03±0.24)%，通过SPSS V13.0软件做t检验，置信区间为97.52%～99.57%，与预测值无显著差异，说明模型与实际相符，具有实际指导意义。酶解物的水解度为24.6%，IC50为0.57mg/mL，说明优化后的酶解条件可有效提高功能肽的制备效率。

中国陶瓷本身是古老的传统产物，具有历史性，我们推行艺术陶瓷的就更应继承中国文化传统的喜闻乐见的文化元素，如以中国传统题材、吉祥题材、中国陶瓷以线造型的优秀传统及中国传统的审美观，强调艺术陶瓷的特色，体现中国文化元素浓郁的东方艺术魅力，成为陶瓷艺术宝库中一颗璀璨的明珠，对西方文化要有清晰的认识，“洋为中用”，而不是追求西方的审美趣味和表现特点，当前有些艺术工作者在艺术陶瓷设计中一味追求油画、抽象画、版画的表现方法和效果，缺乏中国文化元素。面对外来艺术形式时，学习并吸收对自身有用的养分，不是简单的嫁接。

2.4 酶解物的相对分子质量分布

2.4.1 标准曲线

测定Sephadex G-15凝胶柱的V0为17.95mL，Vt为39.94mL，由各标准物的保留时间计算出相应的Ve，进而计算出有效分配系数Kav，制作标准曲线，得标准曲线回归方程为y=－1.2895x+4.3499，R2=0.9978。

2.4.2 酶解物的相对分子质量分布及清除率的测定

图10 泥鳅肉酶解液Sephadex G-15层析图Fig.10 Sephadex G-15 gel chromatographic fractionation of loach muscle hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions

由图10、11可见，具有较高羟自由基清除率的酶解物主要为第1洗脱峰和第2洗脱峰。峰1相对分子质量为2344，IC50为0.36mg/mL；第2峰的相对分子质量为1129，IC50为0.21mg/mL，因此泥鳅肉酶解物抗氧化活性肽是相对分子质量范围在1129～2344的活性肽，经Sephadex G-15层析分离后的组分较酶解物对羟自由基的清除能力有很大提高(IC50下降)。

图11 各分离组分的相对分子质量和对羟自由基的清除率Fig.11 Comparisons on relative molecular mass and hydroxyl free radical scavenging rate of various separated fractions of loach muscle hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions

3 结 论

3.1 通过对酶解进程及羟自由基清除能力研究发现，水解度与清除能力之间没有相关性，酶法制备功能肽的关键可能在于选择适合的酶及酶解条件的优化。

3.2 菠萝蛋白酶作为酶解泥鳅肉制备具有清除羟自由基活性肽的水解酶要优于复合风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。

3.3 响应面分析法优化酶解工艺条件是可行的，优化得到的最佳酶解条件为：加酶量0.2%、温度54.48℃、时间59.97min、pH 6.47、固液比1:4，酶解物对羟自由基的清除率为99.03%，IC50为0.57mg/mL。酶解液中活性肽的相对分子质量范围为1129～2344。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Loach Muscle for Production of Antioxidant Peptides and Measurement of Their Molecular Weights

YAO Dong-rui1，WANG Shu-jun1，LI Yuan-yuan1，PAN Sai-kun1，YANG Fan1,2
(1. School of Food Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；2. Food Engineering College, Dalian Ocean University, Dalian 116000, China)

Q514

A

1002-6630(2010)21-0029-06

2010-06-23

科技部科技人员服务企业行动项目(2009GJC10044)；江苏省农业科技自主创新基金项目(CX09-627)；连云港市科技基础设施建设计划项目(CK0935)

姚东瑞(1966—)，男，教授，博士，研究方向为水产品加工及渔业经济。E-mail：yaodr@hhit.edu.cn