响应面法优化链霉菌HD-010发酵产抗辣椒根腐病菌活性物质条件

张海秀，杜春梅*

(1.哈尔滨学院理学院，黑龙江 哈尔滨 150086；2.黑龙江大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080)

响应面法优化链霉菌HD-010发酵产抗辣椒根腐病菌活性物质条件

张海秀1，杜春梅2,*

(1.哈尔滨学院理学院，黑龙江 哈尔滨 150086；2.黑龙江大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080)

用Plackett-Burman和中心复合(central composite design)试验设计对影响拮抗链霉菌HD-010菌株发酵生产抗辣椒根腐病菌活性物质的9个因素进行筛选优化。结果表明：葡萄糖、蔗糖、玉米粉是发酵培养基中影响抗菌活性物质产量的主要因素。以发酵液效价值为响应值，对3个因素进行中心复合设计，并经响应面法优化分析得到影响抗菌活性物质效价值的二阶模型，确定最优发酵培养基3个关键因素的水平为：葡萄糖质量浓度10g/L，蔗糖质量浓度10.2g/L，玉米粉质量浓度25.8g/L，采用此优化配方，发酵液效价值比原始发酵培养基发酵液提高了55.28%，为进一步生产提供参考。

链霉菌HD-010；发酵；响应面优化

Abstract：In this study, anti-Fusarium solonisubstances were produced by means ofStreptomycesHD-010 fermentation. In order to maximize anti-Fusarium solonipotency, Plackett-Burman (PB) experimental design was initially used to screen the most important affecting factors out of nine ones including medium components and fermentation conditions, followed by central composition design based response surface optimization of three screened factors. Glucose, sucrose and corn flour concentrations in fermentation medium were the most important factors affecting the production of anti-Fusarium solonisubstances and their optimum levels were 10, 10.2 g/L and 25.8 g/L, respectively. The anti-Fusarium solonipotency of the fermentation supernatant obtained under these optimum levels was 71.3784 AU/mL, much higher than before optimization (45.9669 AU/mL).

Key words：StreptomycesHD-010；fermentation；response surface optimization

辣椒根腐病是典型土传病害，一般化学农药难以控制其危害，并且化学农药的长期反复和大量使用，会加重土壤农药的残留，破坏生态环境，使食品的安全性降低，影响人类健康，更不符合农业可持续发展的要求[1-2]。而生物农药具有选择性高、安全性好、易于降解、不易积累、用量少、污染小等优点，因此亟待有新的、有效的微生物农药新品种或新剂型投放市场，以满足该领域的需求。菌株HD-010为微生物学黑龙江省高校重点实验室从黑龙江地区土壤中自行分离得到的一株对辣椒根腐病菌拮抗性较好的链霉菌(Streptomycessp.)，是一株极具开发潜力的生防菌株。

发酵培养基的成分及培养条件对微生物发酵液中抗菌活性物质产量有很大的影响[3-4]。调整培养基中各物质的配比，可以改善菌体的生长条件，提高发酵液效价。响应面分析法(response surface methodology，RSM)是一种优化工艺条件的有效方法[5-7]，其中的中心复合设计应用广泛，可用于确定试验因素及其交互作用在工艺过程中对目标响应值的影响，精确地表述因素与响应值之间的关系。通过利用中心组合试验拟合出一个完整的二次多项式模型，在试验设计与结果表述方面更加准确。近年来，国内外许多学者采用响应面分析的试验方法优化微生物培养基及培养条件都取得了很好的效果[8-13]。本实验通过响应面优化法对链霉菌菌株HD-010的摇瓶发酵条件进行优化，以进一步提高其代谢活性物质的产量，为进一步生产应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

拮抗链霉菌H D-010；指示菌：辣椒根腐病菌(Fusarium soloni)以上菌株均由黑龙江大学微生物重点实验室保藏。

1.2 培养基

原始发酵培养基：葡萄糖25g、蔗糖20g、黄豆粉50g、NaCl 4g、K2HPO40.2g、CaCO33g、蒸馏水1000mL，pH7.0。

1.3 发酵液效价的测定[14]

发酵上清液的制备：将拮抗链霉菌HD-010接入高氏Ⅰ号液体发酵培养基中，28℃、180r/min条件下振荡培养5d，将发酵液在6000r/min，离心10min，取上清液，过细菌滤器，得到发酵上清液即待测液。

采用双层平板法。将10mL琼脂培养基平铺于9cm直径的平皿中，置于水平台面上使琼脂层形成均匀厚度，然后取新鲜培养并稀释到孢子浓度为108个/mL的辣椒根腐病菌菌悬液200μL于温热的6mL PDA琼脂试管中，倒于平皿中，轻轻混匀，置于水平台面上保持培养基厚度一致。在双层检测平板上等距离摆放已灭菌的无菌牛津杯，在牛津杯中加入稀释2倍的200μL待测液，加于3个间隔放置的牛津杯中，以已知效价值的中心浓度发酵上清液为对照加入另外3个间隔的牛津杯中，然后置于指示菌生长温度28℃恒温培养72h，观察抑菌圈的出现，用游标卡尺测定抑菌圈直径，读数精确到0.01mm，重复3个平板。将样品抑菌圈直径与对照抑菌圈直径的差值代入标准曲线中，计算可得样品的效价值。

系列稀释法将发酵上清液用pH7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液进行二倍稀释，取样200μL进行抑菌实验，观察不到抑菌圈出现的最高稀释度定义为一个活力单位(AU)，其倒数即是原液的效价值。

效价值标准曲线的制作：先将经稀释法测量己知效价值的发酵液等比稀释成9种浓度：0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，分别取200μL加于已制备好平板的3个间隔的牛津杯中，同时将200μL中心浓度的发酵上清液(即稀释至0.5倍的发酵上清液)加入另外间隔的3个牛津杯中，每个浓度重复3个平板，以所得到的对应抑菌圈直径的差值为横坐标，对应的效价值的对数为纵坐标，绘制标准曲线。得到的效价值计算公式为y＝0.0436x+1.6021。

1.4 试验设计

以发酵液的效价值为响应值，采用两步法进行优化：首先利用Plackett-Burman设计筛选出对响应值影响较大的因素；然后再利用中心复合设计进行试验，通过试验数据拟合得到二阶响应面模型，最终确定最优试验条件，并进行验证实验。

1.4.1 Plackett-Burman试验设计

根据前期单因素试验结果，用玉米粉代替黄豆饼粉拮抗菌株发酵液的抑菌效果较好。利用Plackett-Burman试验设计，对葡萄糖(X1)、蔗糖(X2)、玉米粉(X3)、氯化钠(X4)、碳酸钙(X5)、磷酸氢二钾(X6)、装液量(X7)、接种量(X8)和pH值(X9)9个试验因素进行筛选，从而筛选出显著因素。每个因素分别取低水平(－1)和高水平(1)，响应值为菌株HD-010发酵液的效价值，其取值见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素水平取值Table 1 Variables and levels in the Plackett-Burman experimental design

1.4.2 中心组合试验

筛选出关键因素后，应用Design-Expert 7.1.3软件，采用中心组合试验设计，以接近最佳值的显著因素取值作为试验中心点进行优化，选择N=20的中心组合试验设计方案，所得结果应用软件进行响应面回归分析。通过回归拟合全局范围内显著因素与响应值间的函数关系，可以得到模型中的各个系数。再对该多元函数进行简单的性状分析可得出其极值点以及取得极值的相应自变量的取值(表2)。

表2 中心组合试验设计因素及水平Table 2 Variables and levels in the central composite design

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验设计结果与分析

Plackett-Burman试验设计结果见表3，采用Design-Expert 7.1.3软件对表3中效价值进行回归分析，得到各影响因子偏回归系数及显著性(表4)。

表3 Plackett-Burman试验设计与结果Table 3 Plackett-Burman experimental design matrix and results

表4 Plackett-Burman试验设计回归分析结果Table 4 Regression analysis for the Plackett-Burman experimental results

由表4可知，方程分析模型的P值为0.0490，表明该模型在被研究的回归区域拟合很好；复相关系数R2=0.9889，说明相关性较好，校正决定系数R2Adj=0.9390表明93.90%的试验数据的变异性可用此回归模型来解释；变异系数(CV)越低，试验的可信度和精确度越高，CV值等于7.68%，表示Plackett-Burman试验的可信度和精确度较好；精密度(adeq precision)是有效信号与噪音的比值，大于4.0视为合理，本试验精密度达到了9.539。

从表4可看出，X1、X2、X3、X8这4个因素的P值小于0.05，为显著影响因素，其中X8为接种量，是正效应因素，而X1、X2、X3均为培养基成分，因此选择X1、X2、X3这3个因素进行中心组合设计，将X8接种量固定为6%。

2.2 中心组合试验设计优化结果与响应面分析

表5 中心组合试验设计及结果Table 5 Central composite design matrix and results

表6 中心组合试验结果二阶方差分析Table 6 Variance analysis for the central composite experimental results

对Plackett-Burman试验中筛选出的显著因素进行优化中心组合试验设计，各因素水平取值见表2，表5为中心组合试验设计及其结果。

采用Design-Expert 7.1.3对试验数据进行分析，拟合二次模型方差分析见表6。F值为5.21，复相关系数R2=0.8388，表明83.88%的发酵液效价的变化可以由此模型解释，说明模型对实际情况拟合较好；模型的P值为0.0110表明该模型显著，可用来进行响应值预测。校正决定系数R2Adj=0.6777表明67.77%试验数据的变异性可用此回归模型来解释；CV值等于11.64%，表示中心组合试验的可信度和精确度较好；本试验精密度达到了9.975。

通过软件Design-Expert 7.1.3进行数据分析，建立二次响应面回归模型，并进而寻求最优相应因素水平，回归方程偏回归系数的估计值见表7。对试验数据进行多项式回归分析，拟合得回归二次方程为：

表7 中心组合试验回归分析结果Table 7 Regression analysis for the central composite experimental results

用Design-Expert 7.1.3绘制回归方程分析图，考察所拟合曲面的形状，响应曲面如图1～3。

图1 葡萄糖和蔗糖质量浓度对菌株HD-010发酵影响曲面和等高线图Fig.1 Response surface and contour plots showing the effects of glucose and sucrose concentrations on the production of anti-Fusarium solonisubstances

图2 葡萄糖和玉米粉质量浓度对菌株HD-010发酵影响曲面和等高线图Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of glucose and corm meal concentrations on the production of anti-Fusarium solonisubstances

图3 蔗糖和玉米粉质量浓度对菌株HD-010发酵影响曲面和等高线图Fig.3 Response surface and contour pots showing the effects of sucrose and corn meal concentrations on the production of anti-Fusarium solonisubstances

由表7和图1～3可看出二次模型中回归系数的显著性：因素C对菌株HD-010发酵液效价的线性效应显著，因素M1和M2不显著；M1M3和M2M3对菌株HD-010发酵液效价交互作用影响显著，而M1M2不显著；对菌株HD-010发酵液效价影响显著，而和M22不显著。

2.3 验证实验

由设计软件得到39组优化条件，选取3组发酵条件进行验证实验，以原始发酵培养基及培养条件为对照，结果见表8。

表8 验证实验结果Table 8 Results of verification experiments on optimized glucose,sucrose and corn flour concentrations

由表8可知，预测精度分别达到了97.72%、95.92%和92.78%，表明实验值和实际值间有较好的拟合性，优化模型可靠。对照组实际测得效价为45.9669AU/mL。证明了Plackett-Burman筛选和中心组合试验设计方法联用对于发酵条件优化的可行性和准确性，因此该方法对于其他发酵条件优化也具有一定的参考价值。

3 结 论

将Plackett-Burman 筛选和RSM分析相结合，成功地应用于链霉菌HD-010菌株发酵产抗辣椒根腐病菌活性物质的条件优化，最终确定优化后的培养基配方及培养条件为：葡萄糖10g/L、蔗糖10.2g/L、玉米粉25.8g/L、氯化钠1g/L、碳酸钙1g/L、接种量6%、装液量30mL/250mL三角瓶、pH8.0、发酵温度32℃、摇床转速250r/min及发酵时间5d。采用此优化配方得到发酵液效价最高值为71.3784，而对照组效价值为45.9669，菌株HD-010最终效价比原始发酵培养基发酵液即对照组提高了55.28%。

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Response Surface Optimization of Medium Composition and Fermentation Conditions for the Production of Anti-Fusarium soloniSubstances byStreptomycesHD-010

ZHANG Hai-xiu1，DU Chun-mei2,*
(1. College of Sciences, Harbin University, Harbin 150086, China；2. College of Life Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China)

Q815

A

1002-6630(2010)17-0340-05

2010-06-29

黑龙江省新世纪高等教育教学改革工程项目(5775)

张海秀(1978—)，女，实验师，硕士，研究方向为应用微生物、微生物发酵技术。E-mail：zhxdd.123@163.com

*通信作者：杜春梅(1972—)，女，副教授，博士，研究方向为生物防治。E-mail：80110507@sina.com