酶固定化技术研究进展

孙建华，戴荣继，邓玉林

（北京理工大学生命学院，北京 100081）

进展与述评

酶固定化技术研究进展

孙建华，戴荣继，邓玉林

（北京理工大学生命学院，北京 100081）

酶在工业化利用之前，必须要经过适当的处理，目的是改善酶的性能。酶固定化技术是改善酶的催化性能最重要、常用的手段。本文介绍了酶固定化技术的最新研究成果（如多点共价结合、单酶纳米粒、磁性纳米纤维、交联酶结晶、交联酶聚集体、分子伴侣、人工油体、适配体等），重点描述了通过固定化来改善酶的催化性能，包括酶的稳定性、活力、立体选择性以及回收利用性能等。

酶；固定化；催化性能

近几年，酶及其固定化酶在化学工业中得到了日益广泛的应用[1-5]。但是酶制剂仍然存在诸多的缺陷[6]。首先，酶大都具有亲水性，而在大多数有机反应中，底物和产物是疏水性的，水的存在会破坏反应的热力学平衡，甚至使反应难以进行；其次是酶活性对外界环境高度敏感，高温、高压、酸碱、反应物和产物浓度的变化都会对酶的活力产生抑制作用；第三是酶的回收利用问题，酶制剂价格昂贵，造成了生产成本的提高。如何解决上述问题，成为酶能否在现代工业中应用的关键所在。涉及很多学科的新技术可以用于改善酶的性能，如定向进化技术[7]、游离酶的化学改性[8]等。固定化技术是最常用的改善酶性能的工具，可以大大改善酶的稳定性、催化活性、选择性和抗抑制性；此外，固定化酶的另一个优点在于它的固体形态，这个特征使人们能够设计灵活多样的固定方法[9]。本文简单概括了固定化技术的最新研究成果，见表 1。重点描述酶固定化可以解决的一些问题，如提高酶的稳定性、酶活力、选择性、抗抑制性及酶的回收利用性能等。

1 提高酶稳定性

在工业生产、储存和应用过程中，酶的三级结构会被破坏，使主要的氨基酸残基不能紧密排列，从而丧失催化活性[10]，因此需要在工业化利用之前对酶进行稳定化，通过固定化技术来改善酶的稳定性是最常用的手段[11]。

表1 固定化酶的研究进展

1.1 多点共价结合固定化

多点共价结合是一种十分有效的提高酶的热力学稳定性的方法[12]。简单的单点共价作用只能把酶固定于载体表面，并不足以使酶形成刚性结构，而多点共价结合通过多个均匀排列的短臂使蛋白上残基的相对距离保持不变，使酶形成了刚性结构，大大提高了酶的稳定性。例如，通过氨基和醛基琼脂糖的多点共价连接，可以将从嗜热脂肪芽胞杆菌中分离的酯酶的稳定性比单点结合的稳定性提高60倍，而比游离酶的稳定性提高了30 000倍，还可以保持游离酶70%的活力[13]。

酶和载体材料往往具有完全不同的几何形状，如何将两个不同刚性的结构连接在一起，不是轻而易举就能办到的，而且，新的化学键的形成也可能会破坏酶的刚性结构，使酶钝化或失活，因此必须严格考虑固定化条件的影响，包括载体的种类、反应时间、pH值、缓冲溶液、反应温度以及添加剂[14]。有的情况下，还需要对酶或者载体进行化学修饰（图1），然后进行固定化[15]。为了最大程度保持游离酶的活性，固定化过程也可以分步进行，如采用含有醛基的载体Sepabeads-EP来固定青霉素酰化酶时，首先进行共价固定，再用氨基酸对载体上的残余醛基进行封闭，这样得到的固定化酶比游离酶的稳定性提高了10000倍[16]。多亚基酶的各个亚单元很难在同一表面上，在这种情况下，可以在共价结合之后，再用功能聚合物进行交联，利用该方法将从Rhodotorula gracilis中得到的D-氨基酸氧化酶进行固定化后，稳定性提高了 7000倍[17]；再如将牛肝过氧化氢酶[18]的不稳定四聚体通过共价键固定于高度激活的醛基琼脂糖凝胶，再用葡聚糖醛（部分氧化的葡聚糖）进行交联，可以得到很好的稳定化效果。

图1 酶的多点共价键结合固定化

1.2 设计酶的微环境

大多数酶的活性在亲水的微环境下才能保持稳定。通过在载体上引入亲水基团很容易创造亲水微环境。例如，使用环氧树脂Eupergit C固定青霉素酰化酶时，用牛血清蛋白对多余的环氧基进行淬灭，并在酶的周围营造了亲水性的微环境，使固定化酶在连续使用50次循环以后仍然未见活力损失[19]，使用小分子试剂如L-赖氨酸、乙醇胺等对载体上剩余醛基或环氧基进行淬灭，也可以使固定化酶更加稳定[20]。另外，也可以在酶和载体之间引入亲水型的长链来创造亲水环境，如将聚乙烯胺与多孔琼脂糖表面的醛基发生反应，然后将蛋白吸附于聚乙烯胺长链中，从而引入了一个适宜酶活性构象的微环境，用这种方法固定化可以使环己酮单加氧酶[21]、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶[22]更加稳定。最近，人们使用半透膜将酶进行胶囊化，一方面可以保证酶不受外界机械力的影响，另一方面可以提供酶适宜的亲水微环境，从而提高了酶的稳定性。

1.3 新材料、新技术的使用

最常用的固定化方式是表面吸附，但吸附固定的最大缺点是酶的泄露带来的活力降低。介孔材料应用于酶的固定化可以有效解决这个问题，在一个小直径的孔中固载了高浓度的酶（图 2），就会阻碍酶的折叠展开或变性[23]。例如，核糖核酸酶 A在中孔氧化硅材料中的固定化可以大大改善其稳定性[24]，酶分子在外界机械力的作用下，体积未见明显变化，这说明酶的结构是保持稳定的。

图2 介孔材料中酶的固定化

影响介孔材料中酶的稳定性的因素很多，包括孔径、孔体积[25]、酶和介孔材料的表面电荷形态[26]等。大孔径的材料经常会造成酶的泄露而影响其长期使用的稳定性，孔径太小又可能造成酶分子无法进入材料；如果酶与材料的表面电荷相反，静电吸附力会提高酶的稳定性，而酶与材料表面的电荷相同，静电斥力就会造成酶的泄露。Ma等[27]将装载了酶的中孔硅载体用乙烯基三甲氧基硅烷进行封闭也可以有效降低酶的泄露；Coradin等[28]则是将中孔氧化硅中注入海藻酸溶液，将 β-galactosidase固定于海藻酸-氧化硅材料中，再用Ca2+诱导凝胶化。多孔材料的制备也可以通过加入致孔剂，然后凝胶化，再去除致孔剂形成多孔凝胶，凝胶的结构限制了酶构象的改变，避免了酶的泄露，增加了酶的稳定性[29]。

多种学科的研究成果经常被应用于固定化技术，可以十分有效地对酶进行固定化，并能够大大改善酶的稳定性。其中报道较多的技术是纳米技术和生物技术。例如，带静电的纳米纤维缠结能够形成多孔结构，可以提高酶的稳定性，其半衰期比自由酶提高了18倍[30]。最近，Kim等[31]报道了该课题小组的单酶纳米粒（SENs）（图3），即将单个酶分子包埋于几纳米厚的多孔有机/无机网络中，研究发现酶的稳定性大大提高，并且没有传质阻力。生物新技术的应用也能够使固定化酶稳定性大大提高，有作者[32]报道了使用极端嗜热分子伴侣与酶进行共固定，可以极大提高酶的热力学稳定性。分子伴侣是体外影响蛋白质折叠的一组蛋白的总称，超嗜热型分子伴侣T.KS-1 cpn发现于真核生物的细胞质中，由两个堆叠的对称环形结构组成。

图3 单酶纳米粒的制备

2 提高酶的活力

固定化酶的活力往往比游离酶的活力低，而且载体占了固定化酶的绝大部分，因此不仅降低了固定化酶的催化能力，而且对工业反应器的体积设计提出了要求。因此，固定化过程需要尽量保持并改善酶的活力，增加单位体积载体的酶装载量。解决的办法包括诱导酶呈现活性构象、增加载体的装载能力和无载体固定化酶等技术。

2.1 诱导酶呈现活性构象

诱导酶呈现活性构象是建立在对酶的结构和催化机制充分了解的基础上，因此人们往往选择青霉素酰化酶、酯酶等作为目标酶。如酯酶在水溶液的状态下，其活性口袋处于封闭的状态，将酯酶固定于疏水表面，就会使酯酶的活性中心处完全开放的状态，从而保证了酯酶的构象始终处于有活性状态[33]；再如青霉素酰化酶[34]，用酰基可以诱导其丝氨酸活性位点完全暴露。表面活性剂的存在也会对酶的构象产生一定的诱导作用，大的表面活性剂分子与酶的活性中心产生了静电结合，使酶的活性口袋始终处于开放的状态（图 4），Fernandez等[35]将酯酶在表面活性剂存在的条件下，进行表面交联，可以得到具有足够刚性的酶结构，有效阻止了酶的封闭构象的产生。此外，有人利用生物素和亲和素特定的亲和作用来固定酶，制备的生物催化膜的活力是随机固定法的20倍[36]。

图4 表面活性剂存在的条件下酶活性中心的开放构象

2.2 增加载体的载酶能力

对于使用多孔材料进行吸附或共价结合的载体而言，载体的孔径和比表面积决定了单位质量的固定化酶的催化能力[37]。在载体上接枝疏水或者亲水的间臂，还可以提供酶适宜的微环境，使酶的构象更加灵活，活力得到改善的同时，酶的固载量也有一定提高[38]。目前研究较多的是用凝胶包埋或胶囊化的手段对酶固定化，不仅可以降低体系中的有机溶剂、底物和产物对酶的抑制作用，也可以提高单位体积固定化酶的载酶量。Barnab等[39]将乙酰胆碱酶包埋于脂质体中，包埋率可以提高到40%，并且通过重组膜孔蛋白来控制脂质体的渗透性，很好地保持了酶的活力。Ariel等[40]将枯草杆菌蛋白酶颗粒包埋于海藻酸微球中，固载量可高达76%，同时，酶的活力也保持了游离酶的93%。

2.3 无载体固定化

无载体固定化酶技术是通过将结晶酶、物理共沉淀的酶进行交联形成固定化酶，包括交联酶结晶（CLEC）、交联酶聚集体（CLEA）（图5）。CLEC早在 1964年就有报道[41]，但由于制备酶结晶的过程比较复杂，因此没有引起人们的足够重视。研究发现[42-44]，CLEC具有良好的热力学稳定性和机械稳定性，在广泛的pH值范围内和有机溶剂中都可以保持活力，残余活力的控制可以通过改变结晶条件来实现，将一些蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶[45]用这种方法固定，还可以有效防止蛋白的自身分解。制备CLEC的前提是需要纯的酶结晶，然而结晶的过程往往十分复杂，为了避免这一过程，人们在研究中发现，改变粗酶液中的化学环境，使酶沉淀、交联形成CLEA，也可以得到与CLEC相当的稳定性和活力[46]。在催化功能方面，CLEC和 CLEA的单位体积活力是传统的载体固定化酶10～1000倍[47]，这非常有利于提高酶制剂的时空产率。无载体固定化酶的研究方向就是将更多的酶进行固定、寻找控制颗粒直径大小的方法、新的沉淀方法、新的交联剂以及对交联酶结晶的活性位点进一步化学修饰等[48]，使这种固定化方式发展成为一项通用技术。

图5 交联酶结晶(CLEC)和交联酶聚集体（CLEA）

3 改善酶的立体选择性

不对称合成是现代有机合成的发展方向，而酶几乎可以催化所有类型的不对称反应，并且可以催化许多金属催化剂无法完成的反应，通过酶的固定化人们可以达到改变酶的立体选择性的目的[49]。

3.1 选择固定化方法

不同的固定化方法会对酶的立体选择性产生重大的影响。例如：从Candida rugosa中得到的酯酶可以用很多不同的方法进行固定：疏水性载体上的界面吸附、PEI-包衣载体上的离子键吸附、含醛基载体的共价吸附等[50]。这些方法可以赋予酶不同的结构和微环境，因此影响酶的活力、专一性以及立体选择性。在催化水解(R,S)-2-phenyl-2-butyroylacetic acid时，界面吸附的酶对S型异构体的E值为1.6～85，但共价固定的酶对R型的异构体的E值高达400，聚合物PEI包衣的酶却只对S型异构体有很小的立体选择性，而水解扁桃酸甲酯时，PEI包衣的载体对S型的异构体的E值为300，而共价固定的方法只有 10。CAO 等[51]分别使用CLEA和CLEC的方式对青霉素酰化酶进行固定，结果发现，CLEA的选择性几乎是CLEC的两倍。以上的例子说明了酶的固定化方法对固定化酶的立体选择性的影响很大。

3.2 控制固定化条件

固定化过程的控制对于酶的立体选择性也会产生重要影响，主要因素包括介质种类、缓冲体系的pH值、温度以及添加剂。Francisc等[52]用溶胶-凝胶法来固定商业酯酶 AK，当酶固定在丙基三甲氧基硅烷产生的溶胶-凝胶介质中时，立体选择性最好，比自由酶提高了7倍；同时，固定化酶对不同的底物的立体选择性也有所不同。Rodrigo等[53]用PEI包衣的琼脂糖凝胶来固定南极假丝酵母酯酶，考察了制备条件对R,S-扁桃酸甲酯不对称水解的影响，发现pH值9.0 和4 ℃下的立体选择性最好。此外，在固定化过程中添加底物、表面活性剂、冠醚或者其它添加剂如乙酰化葡聚糖、多糖、细胞萃取物、金属盐等都可能对酶的结构产生诱导作用[11]，从而改变酶的立体选择性。

4 简化酶的提纯和回收过程

酶要在工业生产上大规模使用，其纯品的制备过程必须简单，固定化酶的回收必须容易。而这两个问题都可以通过酶的固定化来解决。

4.1 酶的固定化纯化

传统的固定化过程必须事先对酶进行纯化，费时、费力，并造成生产成本的提高。现在已经出现了很多技术能够使用粗的细胞裂解液，在固定化的同时对酶进行了纯化。Chung等[54]利用油脂蛋白和油体的特异性亲和作用来固定d-hydantoinase，首先将 d-hydantoinase植入油质蛋白的羧基端，并将融合蛋白在E. coli.中过表达，就会得到大量的融合蛋白，占整个细胞重的30%，将植物油和细胞混合物超声裂解形成人工油体（AOBs），而通过这样的方法固定于AOBs表面的d-hydantoinase表现了很高的耐热性，7轮循环使用后的固定化酶仍然可以使反应达到80%的转化率。近年来发展较快的适配体技术也在酶的固定化纯化中得到了应用，作者课题组利用适配体和某种蛋白之间的特异性亲和作用，可以进行蛋白的提纯，如果将适配体固定在固体材料上（图 6），就可以从细胞裂解液中提纯并同时固定化酶，该方法目前已有报道[55]，尚需进一步研究。

图6 磁性微球-适配体固定化酶

4.2 磁性材料

磁性微球可以用于凝胶化和小颗粒的固定化酶分离纯化，尤其是纳米级的固定化酶。除此之外，还可以利用磁场来控制固定化酶的分散，这就避免了传统的搅拌对酶结构的机械损伤，以提高酶的稳定性[56]。因此，近年来出现了很多利用磁性材料固定化酶的报道。比较常见的是磁性纳米颗粒，包括磁性纤维素微球固定化半乳糖氧化酶[57]、磁性壳聚糖微球固定化漆酶[58]以及磁性高分子聚合物微球固定化Tag聚合酶[55]。除了磁性纳米粒，还出现了磁性纳米纤维，如用过二硫酸铵做引发剂，氧化铁纳米粉末存在的条件下，将苯胺单体聚合形成磁性聚苯胺纳米纤维，酯酶可以在纳米纤维缠结形成的纳米孔中固定，并显示了高度的稳定性[59]。Gülay等[60]先用三价铁和缩水甘油丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯共聚得到磁性微球，然后将磁性微球上的环氧基转化为氨基，再与甲基丙烯酸甲酯接枝共聚，在纳米球的表面就产生了很多带负电荷纤维状聚合物，胰蛋白酶可以通过静电吸附固定在这些细小的纤维之间，并且保持了游离酶活力的84%。目前，以磁性材料为载体的固定化酶在很多领域得到广泛应用，如有机合成、生物传感器以及体内的药物靶向传输等。

5 展 望

近几年来，酶的固定化技术取得了长足的进步，并成为生物化学研究领域的重点和热点。研究者不断对传统固定化技术进行改进，并开发新的固定化方法，一定程度上改善了一些酶的性能，包括稳定性、催化活力、立体选择性和回收再利用性能，他们用实践证明了酶的固定化仍然是最好的改善酶的催化性能的手段。

通过调研，发现传统的固定化方式如吸附、共价结合、包埋很难制备出性能优异的固定化酶。现代酶固定化技术涉及了有机合成化学、生物、材料、分析等多个学科领域，未来的研究趋势必然是多种学科领域的交叉联合，将各个学科领域的新研究成果应用于酶固定化技术，才能推动酶固定化技术的长足发展。

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Progress in enzyme immobilization technique

SUN Jianhua，DAI Rongji，DENG Yulin
（School of Life Science，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China）

Enzyme must be treated properly for properties improvement before implementation at industrial scale，in which enzyme immobilization is the most important and conventional technique.This paper introduces the recent process in enzyme immobilization，including multipoint covalent immobilization，single enzyme nanoparticles，magnetic nanofibers，cross-linked enzyme crystal，cross-linked enzyme aggregate，chaperonin，artificial oil bodies and aptamer. New strategies to obtain immobilized enzyme w ith improved catalytic properties are emphasized，including stability，activity，enantioselectivity，recovery and reuse.

enzyme；immobilization；catalytic properties

Q 814.2

A

1000-6613（2010）04-0715-07

2009-10-23；修改稿日期：2009-12-09。

孙建华（1980—），男，博士研究生。联系人：邓玉林，教授，博士生导师。主要从事生物催化、分析化学、神经生物学、空间生物学等方向的研究。电话 010-68913310；E-mail deng@bit.edu.cn。