强化嗜油微生物对盐碱土中石油类污染物的降解

刘晓艳, 李英丽, 王珍珍, 王 君, 张新颖, 田 翔, 赵 月

(1.上海大学环境与化学工程学院,上海 200444;2.黑龙江省第四地质勘察院,哈尔滨 150001)

强化嗜油微生物对盐碱土中石油类污染物的降解

刘晓艳1, 李英丽2, 王珍珍1, 王 君1, 张新颖1, 田 翔1, 赵 月1

(1.上海大学环境与化学工程学院,上海 200444;2.黑龙江省第四地质勘察院,哈尔滨 150001)

利用从油田试验场油污土壤样品中分离出来的嗜油微生物,选择典型的石油与盐碱土制成的含油污泥作为研究对象.通过实验模拟,研究不同条件下微生物对油类污染物的降解作用特征.实验结果证明:在含水率 50%及施加了氮磷比为 10∶1营养物的样品中,微生物对油污的降解效果最好;通过施加适量的 H2O2,可增强微生物的活性,进而提高微生物的降解油污能力;提供适宜条件,可以有效地加强嗜油微生物的降解能力及其对链烷烃的选择性降解.

嗜油微生物;石油污染物;盐碱土;降解

Abstract:The typical petroleum and oil-contaminated saline-alkali soil were chosen as samples.Aboriginal microorganisms were isolated from petroleum-contaminated soils at the oilfield test site.M icrobial degradation characteristics of petroleum pollutants were studied in simulations under different conditions.Experimental results show that degradation rates of micro-organisms were high in samples under the conditions of 50%water rate and 10∶1 N/P ratio. In addition,the microbial activity and degradation ability can be enhanced by using moderate H2O2to improve the oxygen content in the samp les.If suitable conditions can be provided,degradation and selective consumption of microbes for paraffins can be effectively increased,and used for molecular markersof petroleum pollution.

Key words:aboriginal-microbe;petroleum pollutant;saline-alkali soil;degradation

全世界每年约有近 800万 t石油污染物进入环境,而我国每年有近 60万 t进入环境[1],其中大部分污染物进入到土壤中.石油类污染物中的“三致”物质会被水体和土壤中的动植物所富集,并通过食物链传递给人体.当进入土壤的油浓度过高时,土壤孔隙会被堵塞而影响通气性,并且大量土壤结构的活性表面会被油类包裹,会使嗜油微生物的活性受到抑制,导致其降解能力下降[2].目前,我国每年有近 10万 t石油污染土壤有待解决[3].20世纪 80年代发展起来的微生物修复方法由于其操作简单、费用低、污染物氧化完全、无二次污染、可原位处理等优点,已经成为石油污染治理方法的主流[2-5].

在微生物降解石油烃污染物的过程中,微生物的数量对降解速度有很大的影响,微生物增长率最快的时期最有利于石油烃污染物的快速去除[6].微生物通过不同方式最终将污染物转化为稳定无毒的终产物,如水、CO2、简单醇或酸及微生物自身的生物量[7].影响微生物降解石油的因素十分复杂,包括温度、水分、氧气、pH值、表面活性剂、营养条件等外部条件因素,石油的物理状态、产地、来源和其中所含组分的差异及其浓度都可能影响其降解.我国的石油烃污染土壤中均含有一定数量与活性的除油微生物,其石油烃含量水平与组成特性均有一定的生物降解性,改善油污土的微生态环境非生物因子可取得较理想的生物治理效果[8].土著微生物相对于外源混合菌在石油污染土壤的生物修复中可以发挥更重要的作用[9].微生物的生长繁殖需要碳、氮、氧、磷和其他各种矿物质元素.营养元素是参与微生物细胞组成、构成酶的活性成分、物质运输系统以及提供生理活动所需的能量.在油污土壤中,有机碳含量很高,碳已不是限制条件.但石油烃进入土壤后,会破坏土壤结构,分散土粒,使土壤透水性降低,其与无机氮、磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用,从而使土壤有效氮、磷的含量减少[2].研究表明,氮、磷营养物质的缺乏或过量均可限制石油烃的降解,氮、磷的最佳比例与细胞成分中的比例 (氮磷比为5.67∶1)越接近越有利于提高微生物降解能力[2,6,10-11].Audrew等研究原油在土壤中泄漏后的生物降解能力时发现,当添加肥料的碳、氮、磷的比例为100∶5∶1.7并为缓慢释放形式时,效果最佳,其中 N源主要利用NH4+,P源主要利用 PO34-[12-13].不同原油由于其饱和烃、芳香烃、胶质和沥青质的含量以及饱和烃中正构烷烃的含量不同,而具有不同的抗降解性[6].为了达到较好的修复效果,在向石油污染土壤添加 N,P的营养物时,必须首先确定营养盐的形式、浓度以及适当的比例.

本研究利用某油田受原油污染的典型的盐碱土,从石油污染土壤中筛选出嗜油微生物,然后将其投加到油污土壤中,研究土著微生物专性降解该类土壤的最优营养条件,并对降解效果进行分析.

1 实验材料与方法

1.1 样品

石油污染物样品为某油田 P油层石油.土壤样品为东北地区典型的盐碱土,该土壤中含有氮 1.66 g/kg,磷 2.20 mg/kg.嗜油微生物是取自油田试验场石油污染土壤,并通过分离培养而筛选出的菌群.

1.2 仪器和设备

恒温水浴振荡仪、恒温培养箱、普通天平、电子天平、电热涛、显微镜、多用振荡器、高压锅、热解烃分析仪 (GHM)等.

1.3 药品

H2O2(30%)、原油、葡萄糖、琼脂、蛋白胨、石油醚、硫酸、氯化铵和磷酸二氢钾等,以上试剂均为分析纯.

1.4 实验方法

取 4份盐碱土壤,每份 1 000 g,将土壤自然晾干过 40目筛.另取石油配制成含油量为 100 g/kg的油污土样品,置于 250 mL三角瓶中,保持在恒温空气浴振荡器中,振荡处理 24 d.然后,分别选择不同含水率、含氧量及氮磷营养物等条件进行实验研究,氮磷营养物用氯化铵与磷酸二氢钾配制,按设定的氮磷比投加.选择氮磷比为 6∶1,10∶1,30∶1,50∶1和60∶1五种不同的营养系列进行研究,以 6∶1为例,实验土样中加入的氮、磷浓度分别为2.250,0.375 g/kg.在保持磷浓度不变的情况下,配制其他氮磷比营养系列.例如,配制 100 g/kg油污土实验样品后,向锥形瓶中分别加入氮磷营养物,将制备好的样品放在振荡仪上连续振荡 24 d,期间要注意保持样品的含水率.实验结束后,通过测定样品中有机质的降解率,可以反映出微生物对石油污染物的降解特征.这是因为实验用盐碱土样品中的有机质含量很低,土壤中的石油类污染物是土壤有机质的主要组成部分.样品中石油烃测定方法是将振荡 24 d后的样品取出、晾干、磨细后,通过使用 GHM对样品中的残留烃进行定性和定量分析.

2 实验结果

2.1 含水率对油污降解率的影响

在不同含水率条件下,微生物对含石油污染物浓度为 100 g/kg的油污土试验样品的降解特征如图1所示.

图1 微生物对不同含水率的油污样品中有机质的降解率Fig.1 M icrob ial degradation rate of oil-con tam inated samples under d ifferent moistures

图2 不同营养条件下微生物对油污降解率的影响Fig.2 M icrobial degradation rate of oil pollutants under d ifferent nutr ients

图1可见,油污样品含水率对嗜油微生物降解石油能力的影响比较明显.在含水率低于 50%的条件下,微生物降解石油的能力随含水量的增加而加强;但是,当含水率高于 50%后,随含水量的增加,微生物的降解能力则开始逐渐减弱.实际上,土壤中的微生物需要水来维持基本的新陈代谢.土壤含水量过低,微生物得不到充足的水分供应,细胞活性受到抑制,会导致其代谢速率降低;而土壤含水量过多,会妨碍空气的通透和氧气的供应.根据微生物活性所需的条件,在土壤水分为最大持水量的 30%～80%范围内,石油烃的降解较为有利;在水分低于30%或高于 90%时,对石油烃降解菌的活动就会产生不利影响[14].这一现象说明:微生物的生长繁殖需要一定的含水条件,加之水是微生物一些酶类的必需品;但是,过多的水会阻止微生物与氧气有效的接触,造成微生物缺氧,对微生物降解石油的能力起到抑制作用.

2.2 氮磷营养物对油污降解率的影响

大量实践证明,在众多漏油事故中,氮与磷的含量经常严重限制微生物对石油的降解.营养物质缺乏就会抑制微生物对石油烃的降解作用,并且在自然条件下,氮源和磷源经常成为微生物降解烃类的限制因子[10].在一定油污浓度范围内,适量地增加N源、P源可以加速油污的降解作用.在含水率 50%条件下,不同的氮磷比营养条件下,微生物对浓度为100 g/kg的油污土试验样品的降解特征如图2所示.

微生物的营养物质主要为碳、氮、磷.由于石油污染导致了 C源的大量增加,足以保证其 C源供应,而大多数土壤的 N,P含量都很低.为了达到更好的微生物修复效果,必须添加营养物质,一般需要添加一定量的营养盐,以确保修复过程中微生物生长的需要.本实验设计了五种不同比例进行测试,还有空白对比 (不添加任何营养物质)实验.可以看出,在不同的氮磷比条件下,微生物对污染浓度为100 g/kg的油污盐碱土的降解效果在 10∶1条件下是最好的,而且相对于空白样品,其降解率提高幅度很大 (53.9%).总的看来,实验的各种比例都对微生物的降解有明显的促进作用,但考虑到经济性及降解率因素,选择添加氮磷比为 10∶1最佳.虽然营养物质是影响微生物活性的外因,但它对微生物降解能力的影响是非常明显的.目前国内外的一些研究也证实,在土壤中添加营养物质可以在短时间内使油类污染物的含量大大降低,最佳氮磷比值大约为 10∶1[15].

2.3 加入 H2O2对油污降解的影响

微生物在降解石油烃的过程中不断消耗样品中的溶解氧,使溶解氧的浓度不断下降.本研究在实验中将 H2O2加入到样品中,通过 H2O2不断发生分解以补充被微生物消耗掉的溶解氧.为保持样品中的溶解氧量,每天加入一定量的 H2O2以满足微生物生长的需要.同时,由于 H2O2具有强的氧化作用,若 H2O2加入量过高,就会对微生物产生抑制作用,因此,本研究通过实验确定加入 H2O2量的上限值为 0.5 mL/d.实验过程中,在保证其他因素最佳的条件下,针对 100 g/kg油污土 1～4号试验样品,每天分别施加 0.1,0.2,0.5及 0.6 mL H2O2的条件下,微生物对油污的降解特征如图3所示.

可以看出,氧含量对微生物降解石油能力的影响也是比较大的.随着 H2O2的加入,微生物的活性逐渐加强,降解能力也逐渐提高.当在 24 d内,累计加入H2O2达到12 mL时,降解效率达到最大值.而且可以从含油土壤中微生物数量的测定中得知,试验样品中的活菌数随 H2O2的加入而逐渐提高,活菌数的增加必然会加快油类污染物的降解速度.另外,在加入 H2O2的情况下,泥浆的 pH值可以保持稳定,不发生明显变化.在缺乏电子受体的情况下,微生物对脂肪酸的氧化难于进行,不能将烃类污染物完全氧化,从而使一些短链脂肪酸在试验样品中积聚,致使 pH值下降.若提供了充足的电子受体,就会使微生物将烃类化合物完全氧化成 CO2和H2O,从而使样品的 pH值保持稳定.这有利于微生物的生长繁殖,增强其活性,从而导致微生物的降解效果更加明显[15-16].

2.4 不同氮磷比条件下链烷烃类的降解特征

在不同氮磷比条件下,微生物对污染浓度为100 g/kg的油污样品降解后残留的链烷烃类相对含量如图4和图5所示.由图4和图5可知:在不同氮磷比条件下,当氮磷比为 10∶1时,各种碳数的正构烷烃与异构烷烃在降解后的剩余含量最少;而在其他氮磷比情况下,正构烷烃及异构烷烃的剩余量均较高.实验证明,为嗜油微生物提供适量的营养物质能够有效地加强微生物的降解能力,促使嗜油微生物有效地降解石油中的链烷烃类污染物.同时也反映出:嗜油微生物对 C16～C21范围内的正构烷烃的降解作用是比较均衡的;但嗜油微生物对于 C15～C20范围内的异构烷烃的消耗具有选择性;对 C16类异戊二烯烃及姥鲛烷 (Pr)、植烷 (Ph)的降解率明显低于 C15,C18类异戊二烯烃及姥鲛烯-2(Pr-2)及甲基菲(MP)类异构烷烃.这种选择性降解的特征说明Pr,Ph的难降解性,同时也可以利用 Pr,Ph的稳定性特征,使用 Pr及 Ph作为石油类污染物降解的分子标志物.

图3 不同 H2O2条件下微生物对油污降解率的影响Fig.3 M icrob ial degradation rate of oil pollutan ts under d ifferent H2O2cond ition

图4 在不同营养条件下油污土中正构烷烃的降解特征Fig.4 Degradation character istics of normal alkanes in oily soils under d ifferent nutr ients

图5 在不同营养条件下油污土中异构烷烃的降解特征Fig.5 Degradation character istics of iso-alkanes in oily soils under d ifferent nutr ients

3 结 论

(1)嗜油微生物在油污土壤含水率 50%的条件下降解石油污染物的能力强;

(2)在施加营养物的氮磷比为 10∶1的条件下,微生物对油污的降解效果最好;

(3)含氧量对微生物降解石油能力的影响较大,在施加适量 H2O2的条件下,微生物的活性逐渐加强,降解油污能力逐渐提高;

(4)提供适量的营养物质可有效加强嗜油微生物的降解能力,并可促使其选择性地降解污油中的链烷烃类污染物.实验还证明,嗜油微生物对 C16～C21范围内的正构烷烃的降解作用比较均衡,而对C15～C20范围内的异构烷烃的降解具有选择性.

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(编辑:孟庆勋)

Degradation of Petroleum Pollutants in Saline-Alkali Soils Using Abor iginal M icrobe

L IU Xiao-yan1, L IYing-li2, WANG Zhen-zhen1, WANGJun1, ZHANGXin-ying1,TIAN Xiang1, ZHAO Yue1
(1.School of Environmental and Chemical Engineering,Shanghai University,Shanghai200444,China;2.Fourth Geological Exp loration Institute of Heilongjiang Province,Harbin 150001,China)

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A

1007-2861(2010)05-0460-05

10.3969/j.issn.1007-2861.2010.05.003

2010-07-14

国家自然科学基金资助项目(41073072);上海市重点学科建设资助项目(S30109);黑龙江省教育基金资助项目(10541005);上海大学创新基金资助项目(A10011108009)

刘晓艳 (1962～),女,教授,博士生导师,研究方向为污染环境防治与生态修复.E-mail:lxy999@shu.edu.cn