电子垃圾拆解工人血清中多溴联苯醚代谢产物的识别及其特征

任国发, 于志强, 孙延枫, 马盛韬, 罗湘凡,盛国英, 傅家谟

(1.上海大学环境与化学工程学院环境污染与健康研究所,上海 200444;2.中国科学院广州地球化学研究所有机地球化学国家重点实验室广东省环境资源与保护重点实验室,广州 510640)

电子垃圾拆解工人血清中多溴联苯醚代谢产物的识别及其特征

任国发1,2, 于志强2, 孙延枫1, 马盛韬2, 罗湘凡1,盛国英1,2, 傅家谟1,2

(1.上海大学环境与化学工程学院环境污染与健康研究所,上海 200444;2.中国科学院广州地球化学研究所有机地球化学国家重点实验室广东省环境资源与保护重点实验室,广州 510640)

随机采集广东省贵屿地区从事电子垃圾拆解工人的血液样品作为研究对象,分析多溴联苯醚类污染物在电子垃圾拆解工人血液中可能形成的代谢产物.结果表明,BDE-209不但可以在人体内蓄积,而且还能够发生代谢,生成的羟基代谢产物同样能够蓄积在体内.初步判断,电子垃圾拆解工人血液中新发现的 3个高溴数的羟基联苯醚代谢产物分别为 2个八溴羟基联苯醚和 1个九溴羟基联苯醚.

多溴联苯醚;羟基多溴联苯醚;代谢产物;气相色谱 /质谱;血清

Abstract:Human serum sampleswere collected from an electronic waste(e-waste)dismantling site in South China and analyzed to acquire the information about the polybrominated biphenyl ethers(PBDEs)metabolites in human body.The results indicated that BDE-209 could be bioaccumulated and metabolited into hydroxylated polybrominated biphenyl ethers(OH-PBDEs)in human body.Three OH-PBDEs(two octa-brominated and one nona-brominated congeners)metaboliteswere identified in human serum of the e-waste dismantlingworkers.The higher brominated OH-PBDEsmetabolites in our study were differentfrom that in other studies.

Key words:polybrominated biphenyl ethers;hydroxylated polybrominated biphenyl ethers;metabolite;gas chromatography/mass spectrometry;human serum

多溴联苯醚 (polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是一类备受关注的持久性环境有机污染物,具有一定的神经和甲状腺毒性、弱的环境激素作用以及致癌性,但是目前尚不明确其毒性机理[1].有研究认为,PBDEs的这些生物毒性很可能与其在生物体内代谢后形成的羟基多溴联苯醚 (hydroxylated polybrominated diphenyl ethers,OH-PBDEs)有关[2-3].代谢是决定污染物在生命体中毒性、命运以及生物放大作用的主要因素.虽然 PBDEs的代谢产物——OH-PBDEs的持久性并不如其对应的原型化合物强,但却具有更强的生物化学作用[2-3].OH-PBDEs在分子结构上比其原型化合物更类似于生物体内的甲状腺激素 3,3′,5-triiodothyronine(T3)和 3,3′,5,5′-tetraiodothyronine(T4).相关的结构简式如图1所示.

图1 OH-PBDEs,PBDEs,T3和 T4的结构简式Fig.1 Chem ical structures of OH-PBDEs,PBDEs,T3 and T4

体外实验表明,一些 OH-PBDEs和甲状腺素转运蛋白酶有很强的竞争性结合甲状腺受体蛋白的能力.Hamers等[4]的研究表明 ,4-OH-BDE-42,4′-OHBDE-49,3-OH-BDE-47与 transthyretin(血液中 3种甲状腺激素结合蛋白之一)的结合能力要比甲状腺素强 4倍,5-OH-BDE-47与 transthyretin的结合能力也显著高于甲状腺素.这些外源性物质的竞争结合,势必会造成人体的甲状腺功能紊乱.

为了能够更加全面地了解 PBDEs的环境命运、人体的吸收和消化能力、代谢机理,以及准确评价人体的暴露风险,就必须对这些化合物在人体内的代谢进行更加全面的研究.

1 材料与方法

1.1 样品采集及区域背景

贵屿位于广东省汕头市潮阳区,是全世界最大的电子垃圾拆解基地,每年在此处回收处理的电子垃圾超过百万吨,被称为“世界电子垃圾终点站”.在全世界数量惊人的电子垃圾中,有很大一部分是通过非法手段被运送到贵屿进行拆解处理的.由于拆解工艺非常原始,没有任何的安全措施,因此,在拆解处理的过程中,会产生大量的有害物质,严重地污染贵屿地区的大气、土壤、水和生物体,对当地居民的健康状况造成威胁.本课题组前期的研究结果表明,贵屿地区电子垃圾拆解工人暴露于高浓度的多溴联苯醚,尤其是十溴代联苯醚 (BDE-209)的含量比国外从事类似职业的人群高 50～200倍[5].实验结果引起了国外环境科学家们的广泛关注,建议我们对多溴联苯醚在工人体内的代谢情况进行进一步的研究.本研究随机挑选了 20个在贵屿地区从事电子垃圾拆解的工人血液样品,对多溴联苯醚在人体内的代谢产物进行了初步识别和鉴定.

1.2 样品处理

详细的样品实验室处理过程可参见文献[6],主要包括三个步骤,分别为脂肪的提取、中性组分和极性组分的分离以及两组分的分别去脂净化.中性组分与极性组分的分离是成功分离鉴别出多溴联苯醚的关键步骤,以下作详细说明.提取出的脂肪恒重后用 5 mL正己烷溶解并转移到离心管中,加入10 mL 0.5 mol/dm3KOH的乙醇和水 (1∶1)的混合碱液,振荡,离心分离,取出无机相.此时目标化合物中的极性组分在碱溶液的作用下转变为其盐溶液进入到无机组分,目标化合物中的中性组分停留在正己烷相中.再用 8 mL上述混合碱液萃取一次正己烷相,合并两次所得的无机相溶液,用 10 mL正己烷反萃取一次,两次所得正己烷相合并.至此,中性组分和极性组分分离,分离出的无机相组分再加入6 mol/dm3的盐酸溶液约 2 mL,震荡摇匀,调节 pH<5,还原极性目标化合物.由于 PBDEs在生物体内的代谢产物主要是一些含羟基的化合物,这些化合物如果直接用破坏性去脂方法除脂,可能和浓硫酸起反应,使回收率过低甚至完全被破坏,所以一般都要对该类化合物进行衍生化后再去脂净化.本实验中还原后的极性组分参照中性组分的提取方法浓缩富集,所不同的是,在提取时采用的萃取剂为正己烷和甲基叔丁基醚 (9∶1)混合溶液.为提高仪器的分析灵敏度,极性组分分离后采用重氮甲烷将其衍生化为对应的甲氧基,取代多溴联苯醚进行分析.

1.3 色谱质谱条件

DB-5HT高温毛细管柱 (15 m×0.25 mm×0.25 μm);载气为 He,采用恒流模式,柱流量为 1.2 mL/min,无分流进样,进样量为 1μL;进样口温度 280℃.柱始温 110℃(1 min),以 12℃/min程序升至210℃(1 min),5℃/min升至 250℃(3 min),0.5℃/min升至 275℃(5 min),15℃/min升至 300℃(5 min).

负化学电离源 (negative chemical ionization,NCI):反应气为甲烷,离子源温度 200℃,四极杆温度 150℃,界面温度 300℃.仪器分析时,采用全扫描和选择离子同时监测模式,全扫描检测离子质量范围为M/Z 300～950,选择离子质量分别为 79.0,81.0,406.7,408.7,486.7,488.7.

图2 工人血液样品和高溴数多溴联苯醚标样的色谱图Fig.2 Chromatography of a electron ic waste dismantling worker sample and the higher PBDEs standard

2 实验结果和讨论

2.1 多溴联苯醚在人体内的蓄积代谢

本课题组前期的研究结果表明,贵屿地区电子垃圾拆解工人暴露于高浓度的多溴联苯醚,尤其是十溴代联苯醚 (BDE-209)的含量比国外从事类似职业的人群高 50～200倍[5].代谢是污染物离开生命体的一种重要途径,动物实验表明,PBDEs可以在动物体内代谢成羟基代谢产物.本研究对工人血清中 PBDEs可能的羟基代谢产物进行了分析,识别出3种不同于以往文献报道的高溴代多溴联苯醚羟基代谢产物.由于具体结构信息还不明确,以下分别以M 1,M 2,M 3表示,如图2所示.

由于缺少相关标准品,如何证明发现的 3个化合物是 PBDEs的代谢产物成为本研究的关键.首先,通过过程空白实验和基质加标实验证明,这些新化合物并非是实验过程引入,或者是 PBDEs在样品处理和仪器分析过程中发生化学反应生成的新物质.其次,色谱分析表明,这 3个化合物在非极性毛细管色谱柱上的保留时间均低于十溴联苯醚,分列于 3个九溴联苯醚两侧.结合工人血清样品中 BDE-209的浓度显著高于其他研究人群,我们初步分析工人血清样品中发现的这 3个代谢产物的前驱体为BDE-209.据此可以得出,BDE-209不但可以在人体内蓄积,而且还能够发生代谢,生成的羟基代谢产物同样能够蓄积在体内.

为了获得这些代谢产物尽可能多的结构信息,将 3份样品混合,重新过酸性硅胶小柱净化,采用相同的色谱参数对合并的样品进行全扫描分析,扫描离子质量范围为 M/Z 300～950.在 NCI模式下,含卤联苯醚类化合物一般是从醚键发生断裂,分别形成两个含有醚氧键的碎片峰.本研究发现的 3个化合物都遵循这一原则,质谱谱图如图3所示.

图3中,尽管在 NCI全扫描模式下各化合物产生的分子碎片信息较少,化合物M 1依然产生了许多特征的碎片离子,其主碎片峰由醚键断裂形成.一个主碎片峰为苯环上含有 1个醚氧键 4个溴原子(406.6/408.6);另一个主碎片峰苯环上除含有 1个醚氧键和 4个溴原子,还包含了 1个 OCH3取代基 (436.6/438.6).此外,高质量数逐级脱溴的离子碎片峰也非常明显,推测M 1为含有 8个溴原子的多溴联苯醚甲氧基取代物,每个单环上分别包含 4个溴原子.M 2的质谱特征与M 1类似,其主碎片峰也是醚键断裂后的两个特征离子分峰 (406.5/408.5,438.5/440.5),与M 1所不同的是分子离子和高质量数逐级脱溴形成的碎片离子不明显,推测M 2也是一个含有 8个溴原子的多溴联苯醚甲氧基取代物.相同色谱条件下,M 3保留时间介于 3个九溴联苯醚和 BDE-209之间 (见图2),暗示 M 3可能是一个含有9个溴原子的多溴联苯醚甲氧基取代物.NCI质谱特征表明,M 3的主碎片峰为苯环上含有 1个醚氧键和 5个溴原子的离子 (486.4/488.4).醚键断裂后形成的另一个半分子离子峰 (438.7)属于第三强峰,暗示该粒子不稳定,继续断裂形成苯环上含有1个醚氧键和 4个溴原子 (408.4/410.4)的碎片稳定性更强,属于第二强峰.尽管 NCI质谱给出的结构信息还不是很全面,由M 3主碎片离子的断裂规律也可以进一步推测M 3是一个含有 9个溴原子的多溴联苯醚甲氧基取代物.图4给出了M 1,M 2,M 3可能的结构简式.

图3 化合物M 1,M 2,M 3的 NCI全扫描质谱图Fig.3 NC Imass spectrum of com pound M 1,M 2,M 3

图4 BDE-209在人体血液中可能形成的代谢产物Fig.4 Tentatively identif ied BDE-209 metabolites in serum

2.2 代谢产物的确定

本课题组合成了大量甲氧基多溴联苯醚,采用不同极性的柱系统对所合成的标样与样品中发现的代谢产物进行共柱分析.经对比发现,样品中检出的M 1,M 2分别为两个邻位被羟基取代的化合物,即 6-OH-BDE-199和 6-OH-BDE-196,而 M 3为邻位被羟基取代的九溴多溴联苯醚,即 6′-OH-BDE-206,如图5所示.从文献资料可知,自然源生成的羟基多溴联苯醚的羟基均位于醚键的邻位,由动物代谢实验获得的代谢产物的羟基多取代醚键的间位或对位.而本研究中发现的这 3个代谢产物均为邻位取代产物,与上述结论并不一致,具体原因还有待深入研究.

图5 样品、样品和混合标样共注的色谱图Fig.5 Chromatography of sample and sample sp iked w ith standard m ix

通常多溴联苯醚在动物体内有两种代谢方式:脱溴还原成低溴数联苯醚和催化氧化后插入羟基化形成羟基衍生物.基于本研究中所发现代谢产物,BDE-209在工人体内的代谢途径只可能为脱溴/羟基化产生代谢,而且该代谢方式在其他动物实验中也有发现.在老鼠暴露于 BDE-47的实验中,Marsh等[7]在老鼠粪便中发现了 3种含有 3个溴原子的羟基多溴联苯醚代谢产物.Qiu等[8]在经口和静脉注射暴露于DE-71工业品的实验室大鼠血清中,同样发现了可以定量的 4-OH-BDE-17和 2-OH-BDE-28两种含有 3个溴原子的羟基多溴联苯醚代谢产物.工业品DE-71中含有 3个溴原子的 PBDEs只有 BDE-28,且其含量非常少.事实上,理论上也不存在 BDE-28直接代谢成 4-OH-BDE-17的可能,这进一步说明了这些低溴代谢产物可能是由更高溴数的多溴联苯醚 (如BDE-47等),经脱溴 /羟基化形成的代谢产物.

2.3 国内外相关研究对比

印地安娜大学 Hites[9]课题组和斯德哥尔摩大学的Bergman[10]课题组均对人体内多溴联苯醚的代谢进行过相关研究报道.Bergman[10]课题组研究对象是尼加拉瓜地区一个废物处理厂的儿童.由于经济贫困,这些儿童大多从一出生就生活在废品处理厂,尽管只有 11～15岁,其平均工作年限却长达6 a之久.研究人员发现,这些儿童的血液中 PBDEs原型化合物是对照区儿童的 20～50倍.同时还发现了有 19种 OH-PBDEs存在,且 OH-PBDEs的含量和原型化合物的含量有正相关性.通过与标样比对,对其中的 6种 OH-PBDEs代谢产物进行了鉴定,这 6种代谢产物包括 4个对位取代、1个邻位取代和 1个间位取代产物.由于自然界中天然存在的 OHPBDEs只有邻位取代产物,因此,该研究可以说明PBDEs可在人体内代谢并蓄积在血液中.然而,同样由于缺少必要的标样,该研究未对 7个溴原子以上的高溴代谢产物进行识别.通过简单的计算保留时间以及出峰情况,可初步分析得出该研究所给出色谱图中未识别的高温区的两个代谢产物 (见图6中圈内标注)可能与本研究中的M 1和M 2相对应.Qiu等[9]利用采自印第安纳波利斯州一个医院内 20个怀孕妇女和新生儿脐带血液,分析了血液中PBDEs原型及其代谢产物,从中发现了 7种羟基代谢产物,分别为 4-OH-BDE-42,3-OH-BDE-47,5-OHBDE-47,6-OH-BDE-47,4′-OH-BDE-49,5′-OH-BDE-99,6′-OH-BDE-99,另外还发现了 3种溴酚类化合物.该研究还发现,多溴联苯醚羟基代谢物的蓄积量和原型类化合物处于同一浓度水平.综合两项研究成果,共同之处主要是在人体样品中发现了低溴数的多溴联苯醚 (4溴和 5溴),这和所研究的目标人群体内多溴联苯醚的内暴露情况相一致,其研究对象体内都是以低溴数多溴联苯醚如 BDE-47,BDE-99占主导地位.而本研究中工人血清中高溴数代谢产物占主导,这与所研究人群的暴露特点也相一致.本研究中工人血液中的 BDE-209含量非常高,甚至高出其他职业暴露人群许多倍.

一般来讲,异型物质在人体内特定生物酶的作用下可形成极性较强的代谢产物,增加其水溶性,从而更容易排出体外.然而,本研究却发现,BDE-209的这些代谢产物同样会蓄积在人体血液中,一种可能的解释便是这些新生成的羟基代谢产物能够与血液中的某些转运蛋白酶产生可逆结合作用.体外染毒实验表明,一些低溴数 OH-PBDEs能够和体内甲状腺素产生很强的竞争反应.Hamers等的体外共培养实验表明[4],4-OH-BDE-42,4′-OH-BDE-49,3-OH-BDE-47和 transthyretin(血液中 3种甲状腺激素结合蛋白之一)的结合能力要比甲状腺素强4倍.OH-PBDEs在人体内的蓄积和竞争反应势必会造成人体甲状腺功能紊乱,说明这些代谢产物在生命体内具有比原型化合物更强的生物毒性.

图6 混合血液样品中极性组分的 GC/M S谱图[10]Fig.6 GC-M S chromatogram show ing the presence of OH-PBDEs in the phenolic fraction of human blood[10]

3 结 束 语

本研究对贵屿地区电子垃圾拆解工人血液中可能形成的多溴联苯醚代谢产物进行了分析,研究结果表明:

(1)研究发现BDE-209不但可以在人体内蓄积,而且还能够发生代谢,生成的羟基代谢产物同样也能够蓄积在体内.初步判断电子垃圾拆解工人血液中发现的这 3个高溴数的羟基联苯醚代谢产物,分别为 2个八溴羟基联苯醚 (OH-BDE-199 OH-BDE-196)和 1个九溴羟基联苯醚 (OH-BDE-206),这 3种新发现的化合物可能是BDE-209在人体特定生物蛋白酶的作用下通过脱溴/羟基化形成的代谢产物.

(2)和国外相关研究进行对比,本研究中发现的代谢产物主要是高溴数取代的羟基代谢产物,和国外相关研究明显不同,原因与不同人群暴露于多溴联苯醚同系物的模式不同有关.国外研究的人群体内蓄积的都是低溴数多溴联苯醚如 BDE-47,BDE-99占主导地位,而本研究中的人群暴露的最大特点是BDE-209占主导地位.

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(编辑:丁嘉羽)

Prelim inary Study of Hydroxylated Polybrom inated D iphenyl Ether s(OH-PBDEs)M etabolites in Human Serum of Electron ics D ismantling W orker s

REN Guo-fa1,2, YU Zhi-qiang2, SUN Yan-feng1, MA Sheng-tao2, LUO Xiang-fan1,SHENG Guo-ying1,2, FU Jia-mo1,2
(1.Institute of Environmental Pollution and Health,School of Environmental and Chemical Engineering,Shanghai University,Shanghai200444,China;(2.State Key Laboratory of Organic Geochemistry,Guangdong Key Laboratory of Environment and Resources,Guangzhou Institute of Geochemistry,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510640,China)

X 503.1

A

1007-2861(2010)05-0441-06

10.3969/j.issn.1007-2861.2010.05.001

2010-06-28

国家重点基础研究发展计划 (973计划)资助项目 (2008CB418205);上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金资助项目(SHU09015)

傅家谟 (1933～),男,研究员,中国科学院院士,博士生导师,研究方向为环境污染与人体健康、大气、水体和沉积物等环境介质中毒害有机污染物分布特征、迁移转化与治理技术等.E-mail:fujm@gig.ac.cn