羔羊皱胃酶的两种盐析效果比较研究

宋宏新,马瑛东

(陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安 710021)

羔羊皱胃酶的两种盐析效果比较研究

宋宏新,马瑛东

(陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安 710021)

采用NaCl和 (NH4)2SO4两种盐析剂在 pH4.6、4℃下对羔羊皱胃进行盐析,盐析时间为14 h,比较两种不同的盐析剂的盐析效果.分析经不同饱和度的盐溶液盐析沉淀得到的皱胃酶蛋白含量、活性回收率和纯化效果.结果表明:酶活性回收率较高的为 (NH4)2SO4,其活性回收率为 90%,而纯化效果最好的为 NaCl,可使皱胃酶纯化 2.13倍.

羔羊皱胃酶;酶活性回收率;纯化倍数

0 引言

近年来随着干酪产量的增加,对凝乳酶的需求量不断增大,小牛皱胃酶供应短缺,价格上涨,而成年牛胃中皱胃酶的含量又较少,这就迫使科学家们千方百计地寻找皱胃酶的代用品.羔羊皱胃酶是从 2～4周龄羔羊第四胃中提取的一种凝乳酶,其作用是分解乳中κ-酪蛋白的 Phel05-Met106肽键,使酪蛋白胶粒失去稳定性,在 Ca2+参与下使乳凝固,形成凝乳[1-2].据不完全统计,我国每年屠宰的羔羊大约有 400～500万只[3],利用这些资源提取羔羊凝乳酶,可变废为宝,增加当地农牧民的经济收入,同时也不会造成环境污染,不与其他行业争夺原料,因此羔羊皱胃酶可以成为很好的小牛皱胃酶的替代品,同时还可以解决环境污染问题[4].

在目前的皱胃酶生产过程中,一些厂家为了防止液体凝乳酶在贮存期间微生物污染和活性降低,从而将提取的液体皱胃酶经过盐析沉淀,在低温下干燥后制成粉剂或片剂.因此研究不同盐析方法对羔羊皱胃酶盐析效果的影响可以为羔羊皱胃酶的进一步开发利用和工业化生产提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

皱胃:2～4周龄的哺乳羔羊皱胃 (陕西高陵);全脂羊奶粉:陕西阎良;其他化学试剂均为分析纯.

1.2 羔羊皱胃酶的提取

将 2～4周龄的羔羊屠宰后取出皱胃,清除内容物,剥去脂肪和结缔组织,用手术刀刮下皱胃黏膜 ,混合均匀 ,与 8%NaCl溶液以 1︰10混合.用超声细胞破碎仪在 20℃、20～25 kHz、30 W/cm2超声强度下提取 30 min,然后在 3 000 r/min下离心 15 min,除去杂质.取上清液,即得羔羊皱胃酶原溶液.再用 1 mol/L HCl调整 pH至 4.60,室温下激活 12 h,即可获得皱胃酶溶液[5].

1.3 凝乳活性的测定

取 10 mL 120 g/L的全脂羊奶粉液在 35℃保温 10 min,加入 0.1 mL皱胃酶液,迅速混合均匀,准确记录从加入酶液到乳凝固的时间 (s).把 40 min凝固 1 mL 100 g/L脱脂奶粉的酶量定义为一个索氏单位(Sohxlet unit)[6].

式中:T为凝乳时间,s;D为稀释倍数.

1.4 酶活性回收率及酶纯化倍数[7]的计算

皱胃酶盐析沉淀后,在 7 000 r/min下 4℃离心 20 min,沉淀用 8%NaCl溶液溶解,调 pH至4.60,测定皱胃酶活性,然后用下式计算酶活性回收率:

1.5 蛋白质的测定

采用考马斯亮蓝法,以蛋白质含量为横坐标,以 595 nm处测定的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线.每个样品重复 3次.

1.6 两种盐析方法[8-9]

(NH4)2SO4盐析法:将羔羊皱胃酶原溶液pH调至 4.60,室温下激活 12 h后,取 6份等体积酶液,分别加入 (NH4)2SO4粉末,使溶液中(NH4)2SO4饱和度为 30%、50%、60%、70%、80%、90%,调 pH至 4.60,4℃下放置 14 h,冷冻离心后,取与上清液等体积的 8%NaCl溶液溶解沉淀,测定沉淀中羔羊皱胃酶的凝乳活性及其蛋白质含量.

NaCl盐析法:根据王毕妮[10]的研究,在 NaCl盐析前,激活后的羔羊皱胃酶原液有必要使用A12(SO4)3溶液进行预处理,因为 A12(SO4)3溶液有利于 NaCl的盐析,而且可以除去部分杂蛋白.首先考察不同浓度 0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L、0.25 mol/L、0.3 mol/L的A12(SO4)3溶液的处理效果,加入量为酶液体积的 4%,在室温下静置,待分层后在 4℃下,7 000 r/min下离心 20 min,取上清液,分别测定各上清液的凝乳活性和蛋白含量,选择最优的A12(SO4)3浓度.A12(SO4)3处理后,分别取 7份等体积已激活酶液,各添加已研碎的 NaCl至25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%饱和度,再校正酶液 pH至等电点 4.60,4℃下静置 14 h,7 000 r/min冷冻离心后,用与上清液等量的 8%NaCl溶液溶解沉淀,最后测定沉淀中羔羊皱胃酶的凝乳活性及蛋白质含量.

2 结果与分析

2.1 (NH4)2SO4对羔羊皱胃酶盐析效果的研究

不同硫酸铵饱和度对酶液盐析效果的影响见表1,硫酸铵盐析效果 SDS-PAGE图如图 1所示.

由表1可以看出,随着 (NH4)2SO4饱和度的增加,沉淀中羔羊皱胃酶的活性回收率也逐渐增加,当其饱和度达到一定程度时,活性酶几乎完全沉淀析出;超过此饱和度后,活性回收率就不再提高.(NH4)2SO4饱和度在 30%～60%之间时,酶活性回收率仅为 20%～50%;当 (NH4)2SO4饱和度在 60%～80%时,随着 (NH4)2SO4饱和度的增大,酶活性回收率明显提高,在 (NH4)2SO4饱和度为 80%时,酶活性回收率达到最高为 90%,其纯化倍数也提高了 1.23倍.当随着饱和度的再次提高,凝乳活性反而降低,可能过高的盐析浓度会导致部分酶的失活.由图 1看出随着 (NH4)2SO4浓度的升高,析出的活性物质增多,但其对皱胃酶的纯化效果并不明显,因为 (NH4)2SO4浓度的升高会一直伴随着其他的杂蛋白析出,因此最高只能将其纯化 1.23倍.

表1 不同饱和度的硫酸铵对酶液盐析效果的影响

图1 硫酸铵盐析效果 SDS-PAGE图

2.2 Al2(SO4)3和 NaCl对羔羊皱胃酶盐析效果的研究

2.2.1A12(SO4)3浓度的选择

A12(SO4)3的添加量对羔羊皱胃酶液的影响见表2,硫酸铝处理效果 SDS-PAGE图如图 2所示.

由表2可以看出,随着 A12(SO4)3浓度的增加,上清液中的蛋白含量在不断地减少,说明沉淀中的蛋白含量在增加,与试验现象相符合.而在A12(SO4)3的浓度达到 0.15 mol/L的时候,随着添加量的增加,酶上清液中的蛋白基本不再明显减少,说明A12(SO4)3添加量的增大不会对其除杂效果产生影响,通过图 2观察其处理的效果.随着A12(SO4)3的浓度的增加,其酶液的活性回收率,比活以及纯化倍数都逐渐减少,说明A12(S O4)3除去部分杂蛋白的同时也损失了部分酶活性.因此选择活性回收率以及比活相对较高的 0.1 mol/L A12(SO4)3来处理酶原液.

表2 A12(SO4)3添加量对羔羊皱胃酶液的影响

图2 硫酸铝盐析效果 SDS-PAGE图

2.2.2 NaCl对羔羊皱胃酶盐析效果

不同饱和度NaCl对酶液盐析效果的影响见表3,NaCl盐析效果 SDS-PAGE图如图 3所示.

试验中当 NaCl饱和度在 25%～60%时,未发现有沉淀析出,当饱和度在 60%以上时才有沉淀析出.从表3可以看出,在其饱和度为 65%～85%时,随着 NaCl浓度的升高,其活性回收率在不断升高,直到 75%的时候达到最大值 35.32%,之后随着浓度的升高,活性回收率降低,酶比活及其纯化倍数也有所下降,这是因为随着 NaCl浓度的增大会有部分杂蛋白析出,所以最适的 NaCl饱和度为 75%,在 NaCl饱和度为 75%时羔羊皱胃酶蛋白纯化高达 2.13倍,从电泳图 3也可以看出其纯化效果,基本上没有杂蛋白出现,但是其酶活性回收率相对较低,最高也只有 35.32%.试验发现,经过盐析后的上清液依然具有较高的酶活性(总酶活的 20%),说明除了硫酸铝处理过程中造成酶活损失外,由于经过处理的酶上清液中蛋白含量降低,导致其盐析沉淀不完全也是 NaCl盐析法的酶活性回收率低的主要原因.

表3 不同饱和度的 NaCl对酶液盐析效果的影响

图3 NaCl盐析效果 SDS-PAGE图

3 结论

硫酸铵是目前生产中运用最广泛的盐析剂,由于硫酸铵有非常高的溶解度,其溶液中含有大量的离子电荷和较大的离子浓度,其和NH4+具有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出.本研究中当硫酸铵的饱和度为 80%时,盐析温度为 4℃,盐析时间 14 h时,活性回收率可高达 90.7%,但是其对皱胃酶的纯化效果相对不理想,只有 1.23倍.硫酸铵沉淀的蛋白中含有大量的所以用此法在生产皱胃酶时需要将除去,这样会使皱胃酶生产工艺复杂化,且在去除的过程中可能会对酶活性造成损失,因而不利于酶的生产制备.

食盐饱和度是影响蛋白溶解度的重要因素,通常盐浓度越高,越有利于蛋白凝聚沉淀下来,从NaCl对羔羊皱胃酶盐析结果来看,在盐析温度为4℃,盐析时间 14 h的条件下,当 NaCl在饱和度为 75%时其活性回收率相对很低只有 35.32%.这可能是因为经过硫酸铝处理过后的皱胃酶液中的蛋白含量太少,导致不利于蛋白析出,据报道[11]:在 NaCl存在的较低 pH下,皱胃酶很容易发生自溶,所以其活性回收率很低.但是从纯化程度来看,其对皱胃酶的纯化倍数可高达2.13倍,而且其中的杂蛋白极少,说明 NaCl盐析皱胃酶具有很好的纯化作用,并且在皱胃酶液中是允许有NaCl大量存留的,因此不需要像硫酸铵盐析法那样除盐,如果进一步对 NaCl盐析皱胃酶进行研究,就可以简化羔羊皱胃酶的生产工艺.

羔羊皱胃酶作为奶酪,尤其是高档羊奶酪生产使用的重要凝乳酶有重要的开发前景,生产中对酶制剂中的有限量要求,但合适的 NaCl则为奶酪工艺所需,从两种盐析方法的比较来看,硫酸铵盐析法可以获高达 90%的酶活性回收率,但是其纯化效果不及 NaCl盐析法,要去除硫酸铵盐析物中的会使生产工艺复杂化;NaCl盐析法盐析皱胃酶的纯化效果相对比较好 (可高达2.13倍),无需脱盐操作,因此若能采取措施避免此过程中酶活性的失活,再采用超滤等浓缩技术将处理后的上清液进行适当的浓缩,可以进一步提高 NaCl盐析效率.

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COMPAR ISON OF SALTI NG-OUT EFFECTS OF LAMB RENNET I N T WO SALTI NG-OUT AGENTS

SONG Hong-xin,MA Ying-dong
(College of Life Science and Engineering,Shanxi University of Science and Technology,Xi’an710021,China)

In this paper,we studied and compared the salting-out effects of lamb rennet in t wo salting-out agents,i.e.NaCl and(NH4)2SO4,under the conditions of pH 4.6,temperature 4℃,and salting-out ti me 14 hours.We also analyzed the protein content,the activity recovery and the purification effect of the rennet obtained by salting out in salt solutionswith different saturations.The results showed that the rennet had higher activity recovery of 90%in the(NH4)2SO4salting-out agent;and the rennet had higher purification factor of 2.13 in the NaCl salting-out agent.

lamb rennet;recovery of rennet activity;purification factor

TS201.2

B

1673-2383(2010)05-0038-04

2010-07-26

宋宏新 (1959-),男,陕西兴平人,教授,主要从事生物化学与分子生物学、食品生物安全性及分子免疫检测方面的研究.