Protamex蛋白酶水解小麦面筋蛋白的工艺及产物抑菌作用的研究

周世成,刘国琴,2＊,李 琳,2,何粉霞

(1.河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450052;2.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640)

Protamex蛋白酶水解小麦面筋蛋白的工艺及产物抑菌作用的研究

周世成1,刘国琴1,2＊,李 琳1,2,何粉霞1

(1.河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450052;2.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640)

采用 Protamex复合蛋白酶水解小麦面筋蛋白制备抗菌肽.以抑菌率为指标,以大肠杆菌为目标菌,考察了反应温度、pH、水解时间、底物质量分数、加酶量等因素对抗菌肽生成的影响,在单因素分析的基础上通过正交试验得出小麦面筋蛋白抗菌肽的最佳水解工艺条件:温度55℃、pH9.0、加酶量 200 mg/g、底物质量分数 2.0%,在此条件下得到的抗菌肽对大肠杆菌的抑菌率为 7.2%.抑菌试验结果表明:抗菌肽对金黄色葡萄球菌、黑曲霉和黄曲霉都有一定的抑菌效果,其中,对黑曲霉的抑菌作用最强,抑菌率达到 12.4%.

小麦面筋蛋白;Protamex复合蛋白酶;抑菌

0 前言

小麦面筋蛋白 (谷朊粉)是一种营养丰富的植物蛋白,蛋白质含量非常高,约为 75%～85%,氨基酸组成较为齐全,在食品工业中有广泛的用途.

酶法是一种制备生物活性肽比较安全方便的方法,蛋白质被酶水解可导致分子链内外功能结构的重排,一些原先包埋在分子链内部的功能基团暴露出来,蛋白酶进一步剪切可释放出具有一定生物学功能的肽段[1-3].

目前,人们已从乳清蛋白的酶解物中发现了多种抗菌肽[4],韩晓强等[5]采用中性蛋白酶水解羊骨得到的酶解产物对大肠杆菌、枯草杆菌、藤黄球菌具有明显的抑菌作用,酶解液对它们的抑菌率分别达到了 3.03%、13.71%、19.36%.小麦蛋白中也存在着多种抗菌肽[6],但是含量很少,一般采用直接提取的方法获得,鲜见有采用酶法水解小麦面筋蛋白制备抗菌肽的报道.作者采用Protamex复合蛋白酶水解小麦面筋蛋白制备抗菌肽并研究了它对微生物的抑菌作用,期望为酶解植物蛋白制备抗菌肽提供基础的理论研究与技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料

小麦面粉:河南金苑面粉有限公司;Protamex复合蛋白酶:丹麦 Novo公司.

供试菌种:大肠杆菌 (Escherichia coli)、金黄葡萄球菌 (Staphylococcus aureaus)、黑曲霉 (Aspergillum niger)、黄曲霉 (aspergillus flavus)均购自中国微生物研究所;其他试剂为分析纯.

1.2 仪器与设备

UV—Z102PSC型紫外可见分光光度计:尤尼柯 (上海)仪器有限公司,PHS—3C精密 pH计:上海雷磁仪器厂;150AB型生化培养箱:上海树立仪器仪表有限公司;SYQ—DSX—280B高压蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂;JJJM—54型面筋洗涤仪:上海嘉定仪器厂.

1.3 试验方法

1.3.1 小麦面筋蛋白的制备

准确称取 7.0 g面粉倒入面筋洗涤仪的洗涤杯中制备面筋,洗涤完成后,取出面筋,放入冷冻干燥机进行冷冻干燥.最后将干燥后得到的面筋粉碎,过 120目筛,得到小麦面筋蛋白粉.

1.3.2 碱性蛋白酶活力测定

采用紫外光谱法[7].

1.3.3 小麦面筋蛋白的酶法水解工艺

称取一定量小麦面筋蛋白,用 0.1 mol/L的NaOH溶液溶解,形成一定底物浓度的分散悬浮液,置于反应器中,同时用 0.5 mol/L NaOH溶液调节 pH至所需值.当溶液达到设定反应温度时,加入一定量酶进行水解反应,反应过程中以 0.5 mol/L NaOH溶液维持 pH恒定,反应完毕后调pH至中性,酶解液于 90℃水浴灭酶 10 min,而后用冰水浴迅速冷却,冷冻离心得上清液.

1.3.4 水解度的测定

在中性及碱性条件下采用 pH-stat法[8]测定.蛋白质的水解度(DH)是指蛋白质水解反应过程中被断裂肽键的百分比.

式中:B为消耗的 NaOH碱液体积,mL;Nb为标准碱液 NaOH的浓度,moL/L;α为小麦面筋蛋白的平均解离度;Mp为底物中蛋白质的总质量,g;htot为底物中蛋白质的肽键总数 (毫克当量/每克蛋白质),对小麦面筋蛋白,htot=8.38.

1.3.5 抗菌活性检测方法

抗菌活性检测采用比浊法.将纯化后的待检测菌分别在营养琼脂培养基上划线培养 (真菌在马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)培养基上),选取对数期的待测菌,用 0.85%的 NaCl溶液冲洗固体斜面上的检测菌,稀释后制成一定浓度的悬浊液.在试管中加入 8.9 mL液体培养基,经过高压灭菌后置于无菌操作台上,依次加入 0.1 mL菌液和 1 mL小麦蛋白酶解液,用快速混匀器混匀,用可见分光光度计测其在 600 nm波长处的光密度值A0,然后将其置于 37℃培养箱 (真菌 28℃)中培养 6 h,取出后立刻置于冰浴中终止反应,测其600 nm处的光密度值A,做平行试验取其平均值.按 Hultmark[9]的方法计算抗菌活力,U为抑菌率.

2 结果与分析

小麦面筋蛋白基本成分分析见表1.

表1 面筋蛋白的基本组成%

Protamex复合蛋白酶的酶活力为 0.6×104U/g.

2.1 pH对水解度和抑菌率的影响

以大肠杆菌为指标菌 (以下相同),在底物质量分数 2%,水解温度 60℃,酶用量 225 mg/g,水解时间 100 min的条件下,选择 pH值分别在7.5、8.0、8.5、9.0、9.5时进行水解 ,考察反应 pH值对水解度和抑菌率的影响,结果见图 1.

图1 pH对水解度 DH和抑菌率的影响

从图 1可以看出,pH对抑菌率的影响较大,随着 pH的增加,水解度和抑菌率也迅速增加,当pH为 9.0时水解度和抑菌率均达到最大值,随后pH增加抑菌率又有所下降.酶发挥催化作用须在一定的 pH环境下才能进行,pH的高低会影响蛋白酶在溶液中的解离状态,从而影响酶的活性.对于小麦谷朊蛋白而言,在中性条件的溶液中溶解度很低,它能够溶于稀酸或稀碱溶液中,在碱性条件下,谷朊蛋白在溶液中的构象更易于和蛋白酶结合,从而促进了水解反应的进行.考虑到 pH对抑菌率的影响,选择 9.0为最适 pH条件.

2.2 不同温度对水解度和抑菌率的影响

在固定底物质量分数 2%,酶用量 225 mg/g,pH 9.0,水解时间 100 min的条件下,选择反应温度分别为 40、45、50、55、60 ℃时对面筋蛋白进行水解,考察温度对水解度和抑菌率的影响,结果见图 2.

如图 2所示,水解度和抑菌率先随着温度的升高而增加,达到最高值后又呈下降趋势.Protamex复合蛋白酶水解小麦谷朊蛋白受温度影响较大[10],水解温度超过 50℃后,酶失活速度加快.温度对酶促反应的影响具有两面性,一方面,升高温度有利于加快反应速度,另一方面,温度的升高也加快了酶的失活速度.这主要是温度对蛋白酶分子的稳定性发挥着重要作用,升高温度会使蛋白酶的部分次级键发生解离,蛋白酶的空间结构发生了变化,这样就很难与蛋白质结合,温度较低时,会降低溶液中分子运动的激烈程度,不利于酶和蛋白在溶液中的扩散,从而降低了酶与蛋白结合的机率.从温度对酶催化反应的影响、抑菌率和节能环保的角度考虑,选取 50℃为 Protamex复合蛋白酶水解小麦谷朊蛋白的最适温度.

图2 温度对水解度 DH和抑菌率的影响

2.3 底物质量分数对水解度和抑菌率的影响

在固定酶用量 225 mg/g,pH 9.0,温度50℃,水解时间 100 min的条件下,选择底物质量分数分别在 1%、2%、3%、4%、5%时进行水解,考察底物质量分数对水解度和抑菌率的影响,结果见图3.

图3 底物质量分数对水解度 DH和抑菌率的影响

如图 3所示,水解度和抑菌率都随着底物质量分数的增加呈下降趋势,抑菌率随底物质量分数的增加先增加后下降.底物质量分数增加后会使得溶液中的自由水减少,这直接阻碍了蛋白酶和底物在溶液中的扩散和运动.根据酶促反应原理,高浓度的底物会对酶形成抑制作用,生成的多肽也有可能会反馈抑制酶的水解反应.另一方面,在碱性溶液里,小麦谷朊蛋白浓度较高时还是容易形成面筋小球,溶质的流动性下降了,酶和底物结合的不充分,影响了酶促反应的顺利进行.基于此处考虑,确定 2%为 Protamex蛋白酶水解小麦谷朊蛋白制备抗菌肽的最佳底物质量分数.

2.4 不同加酶量对水解度和抑菌率的影响

在底物 2%,水解温度 50℃,pH 9.0,水解时间 100 min的条件下 ,按照 100、150、200、250、300 mg/g分别加入蛋白酶,以考察加酶量对水解度和抑菌率的影响.

如图 4所示,加酶量在 100～200 mg/g之间时,抑菌率随加酶量的增加呈现快速上升的趋势,超过 200 mg/g后又出现下降的趋势.蛋白质在酶解过程中被水解成大分子的多肽,多肽会被蛋白酶进一步水解成小肽,实际上,在反应溶液中,酶同时作用于蛋白质和多肽,当大部分蛋白质被水解成多肽后,此时,蛋白酶的主要底物已经变成了多肽,水解作用释放出来的的多肽在溶液中具有与蛋白质不同的新构象和新的生物学功能,增加的酶量,可能会将部分肽的功能片段裂解,从而导致其失去生物学功能.考虑到抑菌率,确定水解反应的最佳加酶量为 200 mg/g.

图4 加酶量对水解度 DH和抑菌率的影响

2.5 不同时间对水解度和抑菌率的影响

在固定底物质量分数 2%,水解温度 50℃,pH 9.0,酶用量 200 mg/g的条件下,考察反应时间对水解度和抑菌率的影响,结果见图 5.

图5 反应时间对水解度 DH和抑菌率的影响

如图 5所示,酶解产物的水解度随时间增加而增大,从酶解反应开始到 20 min之内,水解度迅速增加,随后增加趋势变缓.抑菌率在不同时间段有很大区别,反应刚开始时酶解液的抑菌作用并不明显,随着水解时间的延长,抗菌肽的片段不断被释放出来,酶解液的抑菌活性呈增加趋势.酶解液的抑菌率随水解时间的延长有起伏,这有可能是因为具有抗菌活性的多肽被部分水解造成的,或者是酶解所得抗菌多肽的某些重要氨基酸残基遭到破坏所致.对于天然的抗菌肽来说,它们很多拥有修饰基团,可以避免被酶水解.根据水解度和抑菌率的情况,确定最合适的水解时间为80 min.

综合以上单因素试验结果,可以确定 Protamex复合蛋白酶的单因素水解条件为水解时间80 min、酶用量 200 mg/g、pH值 9.0、底物质量分数 2%、水解温度 50℃.

在单因素试验基础上,将反应时间固定在 80 min,选择酶用量 (A)、pH(B)、水解温度 (C)、底物质量分数 (D)4个因素作为试验因子.以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、黄曲霉为指示菌,以平均抑菌率为考察指标,设计了 4因素 3水平L9(34)的正交试验,以确定 Protamex复合蛋白酶水解面筋蛋白制备抗菌肽的优化水解条件.

表2 正交试验因素水平表

表3 正交试验及结果%

由表3 Protamex复合蛋白酶制备抗菌肽正交试验结果,通过极差分析得出影响面筋蛋白酶解物抑菌率的各因素由主到次的排列顺序依次为:加酶量 ＞温度 ＞底物浓度 ＞pH.得出最佳水解条件是 A2B2C3D2,即加酶量 200 mg/g,pH 9.0,温度55℃,底物质量分数 2%,将小麦蛋白在此条件下进行水解验证试验,结果酶解液对各菌的抑菌率为:大肠杆菌 7.2%、金黄色葡萄球菌 8.1%、黑曲霉 12.4%、黄曲霉 10.7%,得到的平均抑菌率为9.60%,结果证明所筛选出来的工艺合理可行.

3 结论

小麦面筋蛋白经 Protamex蛋白酶水解后酶解产物具有一定的抑菌作用,小麦面筋蛋白的水解度与抑菌率之间存在一定的联系,蛋白酶适度水解蛋白可以得到具有较强抑菌作用的抗菌肽.在单因素基础上通过正交试验得到了 Protamex蛋白酶酶解小麦蛋白制备抗菌肽的最佳工艺:温度 55℃、pH 9.0、加酶量 200 mg/g、底物 2.0%.在此条件下对两种细菌 (大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)和两种真菌 (黑曲霉和黄曲霉)的平均抑菌率为9.6%.

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HYDROLYSIS PROCESS OFWHEAT GLUTEN PROTEI N BY PROTAMEX AND ANTI M ICROB I AL PROPERTY OF THE HYDROLYSATE

ZHOU Shi-cheng1,L I U guo-qin1,2,L I lin1,2,HE fen-xia1
(1.School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou450052,China;2.College of L ight Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou510640,China)

In this paper,we prepared antimicrobial peptides by hydrolyzing wheat gluten protein using Protamex.Taking the inhibitory rate as index andEscherichia colias target,the article studied the effects of reaction factors,such as reaction temperature,pH value,hydrolysis ti me,substrate concentration and Protamex amount on the preparation of antimicrobialpeptides.Based on the single factor experiments,the optimal hydrolysis conditionsof the anti microbialpeptideswere obtained as follows by orthogonal experi ment,temperature 55℃,pH value 9.0,Protamex amount200 mg/g,and substrate concentration of 2.0%.Under the optimal conditions,the inhibitory rate of the antimicrobial peptides toEscherichia coliwas up to 7.2%.The anti microbial test results showed that the antimicrobial peptides had effects in inhibitingStaphylococcus aureus,Aspergillus nigerandAspergillus flavus,wherein the antimicrobial peptides had the highest inhibition effect onAspergillus niger,and the inhibition rate was up to 12.4%.

wheat gluten;Protamex;inhibition

TS201.2

B

1673-2383(2010)05-0013-05

2010-06-11

国家自然科学基金资助项目 (20976036);河南省杰出人才基金资助项目(074200510008);河南省科技攻关基金资助项目 (072102270023);中国博士后基金(20070420775)资助项目

周世成 (1977-),男,河南郑州人,硕士研究生,研究方向为蛋白质和生物技术.

＊通信作者