模拟内分泌和外分泌ANP对胃EC细胞5-HT合成与分泌的影响

徐贝贝，李春辉，张德利

(承德医学院附属医院病理科，河北承德 067000）

模拟内分泌和外分泌ANP对胃EC细胞5-HT合成与分泌的影响

徐贝贝，李春辉△，张德利

(承德医学院附属医院病理科，河北承德 067000）

目的:观察模拟内分泌和外分泌心房钠尿肽(ANP)对胃肠嗜铬(EC）细胞合成与分泌5-羟色胺(5-HT）的影响。方法:通过胃腔直接注射ANP模拟外分泌，通过舌下静脉注射ANP模拟内分泌，采用免疫组织化学染色、透射电镜超微结构的测量学方法和高效液相色谱电化学检测方法观察ANP刺激后胃内5-羟色胺免疫反应细胞密度、内分泌颗粒(SG）数密度及血清5-HT的含量。结果:模拟ANP外分泌，实验组5-HT免疫反应阳性细胞密度、SG数密度明显高于对照组(P＜0.05），实验组血清5-HT含量明显低于对照组(P＜0.05）;模拟ANP内分泌，实验组5-HT免疫反应阳性细胞密度、SG数密度明显高于对照组(P＜0.05），实验组血清5-HT含量明显低于对照组(P＜0.05）。结论:模拟大鼠内、外分泌ANP可抑制5-HT的分泌，促进5-HT的合成。

心房钠尿肽(ANP);肠嗜铬细胞;5-羟色胺(5-HT);胃

自1981年de Bold等首次从心房中提取心房钠尿肽(ANP）以来，人们又相继发现了BNP、CNP、DNP、MNP和VNP[1-2]。它们不仅存在于心脏而且分布于全身许多部位[3-4]。本课题组的前期研究证实，大鼠胃中的ANP合成细胞是胃的肠嗜铬细胞即EC细胞，EC细胞的分布密度与微血管的分布密度密切相关;胃中的5-羟色胺(5-HT）也是由胃EC细胞合成并由EC细胞的分泌颗粒贮存和分泌[5]。ANP对胃EC细胞分泌5-HT有何影响，国内外尚未见报道。为此，本研究通过胃腔直接注射ANP模拟外分泌产生的ANP，通过舌下静脉注射ANP模拟内分泌产生的ANP，采用免疫组织化学染色、透射电镜超微结构的测量学方法和高效液相色谱电化学检测方法，观察了ANP刺激后胃合成和分泌5-HT的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 体重300-350g，3月龄雄性成年Wistar大鼠，由承德医学院附属医院中心实验室提供，术前24h禁食、自由饮水。

1.2 药物与试剂 兔抗大鼠5-HT抗体，美国Santa Cruz公司;ANP标准品，美国Sigma公司;5-HT标准品，美国Sigma公司。

1.3 模型制作方法

1.3.1 制作模拟外分泌动物模型:成年Wistar大鼠20只，腹腔注射1%戊巴比妥钠(50mg/kg）麻醉，打开腹腔，分别结扎幽门、贲门。实验组(10只），胃内直接注射ANP 28μg(14mg/L）;对照组(10只），胃内注射2ml生理盐水。手术后60min左心室取血，离心取血清;取胃，置中性甲醛和戊二醛的混合固定液固定，用于光镜和电镜观察，血清用于高效液相色谱检测。

1.3.1 制作模拟内分泌动物模型:另取成年Wistar大鼠20只，腹腔注射1%戊巴比妥钠(50mg/kg）麻醉。实验组(10只），舌下静脉注射ANP 14μg;对照组(10只），舌下静脉注射1ml生理盐水。注射后60min，左心室取血，离心取血清;取胃，置中性甲醛和戊二醛的混合固定液固定，用于光镜和电镜观察，血清用于高效液相色谱检测。

1.4 免疫组织化学染色 固定胃组织常规石蜡包埋，切片(5μm)。SP免疫组化法观察胃EC细胞5-HT阳性信号的表达，一抗稀释浓度1:200，DAB显色，苏木素复染。以PBS代替一抗作为阴性对照，以胞浆出现棕色颗粒为阳性信号表达。定量分析:每只大鼠随机挑选5张切片，每张切片随机选取10个高倍视野(×400）进行记数，以每个高倍视野5-HT免疫反应阳性细胞的密度作为5-HT的相对表达水平，取平均值。

1.5 透射电镜观察和形态计量 固定胃组织Epon812包埋剂包埋，醋酸双氧铀染色和柠檬酸铅染色，JEM-1200EX透射电镜观察。观察胃EC细胞的分泌颗粒(SG），采用Chun-hui等[5]的方法计量SG的数密度。

1.6 高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD）检测血清5-HT的含量 血清样品1:10稀释，过滤后加入Zorboxsb-C18色谱柱(4.6mm×15mm，3.5μm），上样量5μl。洗脱液(流动相）A:20mml/L的枸橼酸三钠(pH=4.50）、B:甲醇，A:B=85:15，柱温25℃，流速1ml/min。

1.7 统计处理 SPSS 11.0统计软件进行统计分析，组间比较采用t 检验。

2 结果

2.1 模拟ANP外分泌对大鼠胃5-HT分泌的影响

实验组5-HT免疫反应阳性细胞密度、SG数密度明显高于对照组(P＜0.05），实验组血清5-HT含量明显低于对照组(P＜0.05）。见附表。

附表 模拟ANP内、外分泌对胃EC细胞5-HT分泌的影响(±s）

附表 模拟ANP内、外分泌对胃EC细胞5-HT分泌的影响(±s）

*与对照组比较:P＜0.05

组别 n 胃5-HT阳性 SG数密度 血清5-HT含量细胞密度 (μg/ml）模拟外分泌 对照组 10 32.23±1.79 13.97±1.71 548.01±58.79实验组 10 46.17±1.77*19.98±3.19*446.12±37.7*模拟内分泌 对照组 10 29.20±1.87 12.98±1.92 597.56±44.7实验组 10 56.15±2.23*22.27±3.40*324.34±24.3*

2.2 模拟ANP内分泌对大鼠胃内5-HT分泌的影响

实验组5-HT免疫反应阳性细胞密度、SG数密度明显高于对照组(P＜0.05），实验组血清5-HT含量明显低于对照组(P＜0.05）。见附表。

3 讨论

近年来，国内外对ANP的研究主要集中在心肌细胞，ANP阳性细胞主要集中在右心房，较少分布在左心房，左心室几乎不存在[6-7]。有研究发现，在胃组织中也有合成ANP的细胞，ANP合成细胞是胃中的肠嗜铬细胞，即EC细胞[8-9]。ANP合成后储存在高尔基复合体周围的内分泌颗粒中，并且ANP与5-HT共同在胃的EC细胞中合成并且存在于EC细胞的同一分泌颗粒中[5]。这种存在方式可能具有某些特殊的生理功能，但关于ANP对EC细胞5-HT合成与分泌影响的研究目前国内外尚未见报道。本研究通过在大鼠胃腔内直接注射ANP，模拟研究外分泌产生的ANP对5-TH分泌的影响，以及通过在大鼠舌下静脉注射ANP，模拟研究内分泌产生的ANP对5-TH分泌的影响，观察ANP对5-HT合成及分泌的影响，探讨EC细胞中的ANP和5-TH的相互关系。

本研究发现，胃腔内及舌下静脉注射ANP后，胃组织5-HT免疫反应阳性细胞密度及分泌颗粒的数密度明显增加，因此推测ANP可能对5-HT的合成起促进作用，使5-HT在EC细胞内的分泌颗粒内积累，从而导致5-HT免疫反应阳性细胞数及分泌颗粒的数密度增多。本研究同时发现，无论是模拟内分泌、还是外分泌，血清中的5-HT含量却明显减少，因此推测ANP可能对5-HT的释放具有抑制作用。本研究发现模拟内、外分泌ANP均可影响胃内5-HT的合成和分泌，而胃内5-HT分泌异常可导致胃肠道疾病特别是胃动力性疾病。因此本研究可为进一步研究胃内5-HT分泌异常导致的胃肠道疾病提供新思路，同时也可为消化生理与病理的研究提供理论依据。

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EFFECTS OF SIMULATING ENDOCRINE AND EXCRINE ANP ON SYNTHESIS AND SECRETION OF 5-HT OF EC CELLS IN STOMACH

XU Bei-bei, LI Chun-hui, ZHANG De-li
(Department of Pathology, the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate effects of simulating endocrine and exocrine atrial natriuretic peptide (ANP) on synthesis and secretion of 5-HT of enterochromaffin cells (EC) in stomach. Methods:ANP was directly injected into the stomach to simulate exocrine secretion and ANP was injected into the sublingual vein to simulate endocrine secretion. Immunochemical staining, transmission electron microscope and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection were used to observe 5-HT expression, dissector of secretory granules (SG) and 5-HT content in serum.Results:Simulating exocrine: compared with control group, the 5-HT expression, the disector of SG were obviously increased in EC cells of rats in experimental group (P＜0.05), but the 5-HT content obviously decreased (P＜0.05). Simulating endocrine: compared with control group, the 5-HT expression, the disector of SG were obviously increased in EC cells of rats in experimental group (P＜0.05), but the 5-HT content obviously decreased (P＜0.05).Conclusions:Simulating exocrine and endocrine of ANP all can inhibit secretion of 5-HT and promote synthesis of 5-HT.

ANP; Enterochromaff n cell; 5-HT; Stomach

R335

A

1004-6879(2010）04-0358-03

2010-05-27）

△ 通讯作者