酶解产物人参皂苷Rh2、Rh3的二氯甲烷层析分离

史 承， 吴 警， 富 瑶 瑶， 鱼 红 闪， 金 风 燮

( 大连工业大学 生物与食品工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

人参中的主要有效成分是人参皂苷[1]，一些稀有人参皂苷具有极高的生理活性。其中人参皂苷Rh2具有良好的抑制肿瘤细胞、诱导分化癌细胞、具有抗浸润和抗转移、增加免疫力、化学抗癌药物的增效减毒、抗致癌物质的性能，是配合放疗、化疗增效减毒的首选药物。人参皂苷Rh3具有高抗癌作用，还可以诱导不同的HL-60细胞，使之成为形态学上的和功能上的粒细胞[2]。

在生产红参或酶转化处理人参二醇类皂苷 PPD 的过程中，人参二醇类皂苷20位和3位碳上的糖基被水解，生成 20(S,R)-Rg3和20(S,R)-Rh2等皂苷；其中Rg3皂苷20位碳上的—OH与22位碳上—H脱水生成反式的20、22碳烯Rg5和顺式的20、22碳烯Rg5即Rk1；同样Rh2皂苷20位碳上的—OH与22 位碳上—H容易脱水生成反式的20、22碳烯Rh3和顺式的20、22碳烯Rh3即 Rk2。

但是这些衍生物在传统红参中的含量甚微[1]。本实验室成功地实现酶转化法从人参二醇类皂苷生产 Rh2等稀有皂苷；赵立亚等[3]应用硅胶柱法分离人参二醇类皂苷，通过酶法改变人参二醇皂苷糖基，成功得到稀有人参皂苷Rh2。吕迪等[4]应用氯仿-甲醇作为洗脱液在常压下对人参皂苷Rh2和Rh3混合物进行硅胶柱分离，成功得到稀有人参皂苷Rh3。采用氯仿-甲醇作为硅胶柱分离的洗脱液，由于氯仿毒性较大、危险性高、价格较贵、不容易购买，因此尝试用二氯甲烷-甲醇作为硅胶柱的洗脱液对人参皂苷Rh2和Rh3进行分离。其中20(S,R)-Rh2和顺、反Rh3结构如图1所示。

1 材料与方法

1.1 材 料

人参皂苷Rh2、Rh3标准品和人参皂苷混合皂苷(Rh2、Rh3等)由本实验室提供；薄层层析板Silica gel 60-F254，德国Merck公司；硅胶，青岛海洋化工厂；高效液相色谱仪Waters 2695-2996。

1.2 方 法

1.2.1 二氯甲烷-甲醇作为洗脱剂层析分离人参皂苷Rh2、Rh3

人参皂苷Rh2、Rh3的分离选用常压硅胶柱层析法，采用二氯甲烷-甲醇作洗脱液分离。

制样品胶：取待分离样品10 g用尽少量的工业甲醇充分溶解。称量80～100目硅胶75 g，将其加入到溶于甲醇的样品液中，60～70 ℃边加热边搅拌均匀，待其完全蒸干，制成样品胶。

装硅胶柱：脱脂棉铺于玻璃硅胶柱底部，取300～400目硅胶600 g作为分离胶，用漏斗慢慢装入到玻璃柱内，使其铺放均匀，并于下面抽真空使其紧实后，加入一层2～3 cm高的80～100目硅胶，起缓冲作用，再于其上加入已制好的样品胶，最后于最上方铺脱脂棉，待用。

梯度洗脱：柱装好后，首先用二氯甲烷通柱，柱子打通后，以V(二氯甲烷)∶V(甲醇)= 7∶0.1～7∶0.3为流动相进行梯度洗脱。此过程由薄层层析检测监控，调整洗脱液中二氯甲烷与甲醇的比例，根据薄层层析检测结果收集洗脱液，每瓶收集250 mL，直至人参皂苷Rh2和Rh3被完全洗下。最后用纯甲醇洗脱，点板至样品全部洗下。

1.2.2 薄层层析法法(TLC)

用刻度毛细管吸取标准品及样品，点样于薄层层析板上。将点好样品的薄层板放入层析缸的展开剂中，展开剂配比为V(二氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶1.8∶0.5，10%硫酸加热显色。

1.2.3 高效液相色谱法(HPLC)[5,6]

色谱仪，美国Waters 2695仪器；检测器，Photodiode Array Detector Waters 2996仪器；色谱柱，Hypersil ODS2 5 μm (4.6 mm×200 mm)；工作温度，20 ℃；柱温，35 ℃；体积流量，1.0 mL/min；样品进样量，10 μL；检测波长，203 nm；流动相，乙腈-水。

样品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rh2、Rh3各1 mg，用色谱醇定容至1 mL，摇匀，待用。

人参皂苷Rh2、Rh3流动相洗脱条件如表1、2所示。

表1 人参皂苷Rh2流动相梯度条件表Tab.1 Gradient Parameter of HPLC Mobile Phase

表2 人参皂苷Rh3流动相梯度条件表Tab.2 Gradient Parameter of HPLC Mobile Phase

2 结果与讨论

2.1 二氯甲烷-甲醇作洗脱剂分离

人参皂苷Rh2和Rh3的混合物用常压硅胶柱分离。10 g 样品上硅胶柱，分别采用V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=7∶0.10、7∶0.13、7∶0.15、7∶0.18、7∶0.2、7∶0.3渐变梯度进行洗脱。当梯度达到7∶0.3时，人参皂苷Rh2和Rh3先后流出，第60瓶开始有Rh3单点洗下，第68瓶到第86瓶为Rh2和Rh3的混合物，从87瓶开始有Rh2单点出现直到112瓶。部分TLC跟踪结果如图2所示。

Rh3，人参皂苷 Rh3标准品；Rh2，人参皂苷Rh2标准品；样，样品；54～114，瓶号图2 硅胶柱法分离人参皂苷Rh2和Rh3的TLC检测Fig.2 Ginsenoside Rh2 and Rh3 separated by silica gel column on TLC

将洗脱出来的人参皂苷合并收集，浓缩干燥，收集称重，各部分皂苷质量见表3。

表3 人参皂苷分离收集表Tab.3 The collection of ginsenoside separation

得到较纯的人参皂苷Rh2组分的质量为2.47 g，得率为24.7%；较纯的人参皂苷Rh3组分的质量为0.41 g，得率为4.1%；人参皂苷Rh2和Rh3的混合部分的质量为0.88 g，得率为8.8%；为了测定分离出人参皂苷Rh2和Rh3的纯度，采用高效液相色谱法进行检测。

2.2 高效液相色谱检测样品纯度

利用高效液相色谱，对所分离出的人参皂苷Rh2和Rh3进行纯度检测。

称取l mg分离出的人参皂苷Rh2，溶于l mL色谱甲醇中，HPLC检测结果如图3所示。

图3 人参皂苷Rh2高效液相色谱图Fig.3 Ginsenoside Rh2 on HPLC

参照文献[7]，从高效色谱图可以看出，22.390 min出现的峰为人参皂苷20(S)-Rh2，23.039 min出现的峰为人参皂苷20(R)-Rh2，其纯度可达到85%以上。

称取l mg分离出的人参皂苷Rh3，溶于l mL色谱甲醇中，HPLC检测结果如图4所示。

图4 人参皂苷Rh3高效液相色谱图Fig.4 Ginsenoside Rh3 on HPLC

参照文献[7]，从高效色谱图可以看出，31.313 min出现的峰为人参皂苷顺式的20、22碳烯Rh3，31.960 min出现的峰为人参皂苷反式的20、22碳烯Rh3，其纯度可达到95%以上。

3 结 论

采用硅胶柱层析法，采用二氯甲烷-甲醇洗脱液分离得到的单组分人参皂苷Rh20.41 g，单组分人参皂苷Rh32.47 g，通过HPLC检测，22.390 min出现的峰为人参皂苷20(S)-Rh2，23.039 min出现的峰为人参皂苷20(R)-Rh2，Rh2纯度可达到85%以上。31.313 min出现的峰为顺式的20、22碳烯人参皂苷Rh3即Rk2，31.960 min出现的峰为反式的20、22碳烯人参皂苷Rh3，纯度可达到95%。本实验应用二氯甲烷作为洗脱液成功分离出单体人参皂苷Rh2和Rh3，从高效液相色谱图中看出，经硅胶柱层析法分离得到的皂苷分别为人参皂苷20(R,S)-Rh2和顺、反式20、22碳烯人参皂苷Rh3，本实验的研究为实现人参皂苷产业化提供了一定依据。

[1] 金凤燮. 天然产物生物转化[M]. 北京:化学工业出版社, 2009:79-81.

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[3] 赵立亚,鱼红闪,金凤燮. 酶法生产稀有人参皂甙及其产物成分的分析[J]. 大连轻工业学院学报, 2002, 21(3):112-115.

(ZHAO Li-ya, YU Hong-shan, JIN Feng-xie. Preparing rare ginsenoside from enzyme reaction and composition analysis of its products [J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2002, 21(3): 112-115.)

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