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RACE技术对薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA 3′末端的快速扩增

2010-09-26金凤燮鱼红闪

大连工业大学学报 2010年3期
关键词:皂苷元薯蓣琼脂糖

骆 宁,金凤燮,鱼红闪

(大连工业大学 生物与食品工程学院,辽宁 大连 116034)

0 引言

穿龙薯蓣,味苦性平[1],含有丰富的薯蓣皂苷元。其根茎既是生产治疗心血管疾病药物的主要药源[2],又是用于合成多种甾体激素类药物和避孕类药物的重要原料之一[3]。薯蓣皂苷经代谢产生的薯蓣皂苷元是发挥作用的真正有效成分,临床报道薯蓣皂苷元对治疗冠心病、康动脉粥样硬化、降血脂、平喘、抗炎和抗肿瘤都有一定的疗效[4]。研究显示,多糖基的薯蓣皂苷元在生命体中首先水解掉糖基,成为低糖基的薯蓣皂苷元才会被生命体所吸收发挥疗效,因此对薯蓣皂苷元的糖基进行水解是非常必要的。本实验室前期已经筛选出产薯蓣皂苷糖苷酶的Absidiasp.G3d菌,并且得到高活力的薯蓣皂苷糖苷酶,该酶能够特异性的水解薯蓣皂苷上的鼠李糖基,生成低糖基薯蓣皂苷元。

cDNA末端快速扩增技术即RACE技术(Rapid-Amplification of cDNA Ends),是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术[5],是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5′和3′末端的有效方法[6],以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视[7]。本实验就是利用RACE技术,获得薯蓣皂苷糖苷酶cDNA 3′端的未知序列。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

Absidiasp.G3d来源于大连工业大学生物与食品工程学院菌种保藏所。

1.1.2 培养基

察氏培养基,实验室自制液体培养基:40mL麸皮浸出液+60mL穿山龙浸出液,121℃高温高压灭菌后使用。

1.1.3 仪器与设备

HimacCF15R型高速冷冻离心机,JM-250型电泳仪,2816型快速离心机,PCR仪,紫外分析仪,UV-120-02型分光光度计,SK-1型快速混匀器,BCD-272AY型容声冰箱。

1.1.4 主要试剂

3′RACE cDNA Amplification Kit,RNAiso Reagent,LA Taq,DNaseI(RNase Free),RNase Inhibitor,DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司;液氮由中国科学院大连化物所提供;苯酚、氯仿、异戊醇、乙醇等均购自天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 3′RACE试剂盒简介

本实验使用了3′RACE cDNA Amplification Kit,该试剂盒能够特异性的扩增cDNA 3′末端全长。其中含有Reverse Transcriptase M-MLV(RNaseH-),同时含有特异性引物:

3′RACE Adaptor Primer:含有dT区域及Adaptor Primer部分;

3′RACE Outer Primer:TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT;

3′RACE Inner Primer:CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG。

1.2.2 3′RACE试剂盒原理

进行3′RACE实验时,首先由Reverse Transcriptase M-MLV(RNaseH-)与3′RACE Adaptor Primer将Poly(A)+RNA反转录成cDNA,再使用TakaRa LA Taq及上游外侧特异性引物和3′RACE Outer Primer,以反转录的cDNA为模板,进行一次PCR反应。如果未能得到目的产物再使用上游内侧特异性引物和3′RACE Inner Primer进行二次PCR反应。(具体原理见图1)

图1 3′-Full RACE Kit试剂盒扩增cDNA 3′末端基因序列过程Fig.1 Procedure of amplification of 3′cDNA ends by 3′-Full RACE Kit

1.2.3 引物设计

根据已测定的薯蓣皂苷糖苷酶基因CDS区的已知序列设计特异性引物,同时考虑到真菌密码子的偏好性,设计出如下特异性引物:

上游外侧引物F1:5′-AACGCCTGCGGACT GGCGATCGCAAGG-3′27mers;

上游内侧引物F3:5′-CAACAAGGGTGCT TCGGGTGATT-3′23mers。

1.2.4 总RNA的提取

使用RNAiso Reagent提取米曲霉菌体总RNA,流程如下:

低温冻结的菌体→加入液氮研磨→加入适量的RNAiso Plus后匀浆→室温静置5min→加入1/5RNAiso Plus体积的氯仿→室温静置5min→12 000r/min 4℃离心15min→移至新离心管中加入等体积异丙醇→室温静置10min→12 000r/min 4℃离心10min→向沉淀中加入1mL的75%的乙醇→12 000r/min 4℃离心5min→弃上清,沉淀溶于适量的DEPC水中。取1μL进行3%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5 cDNA的反转录合成

反转录合成cDNA,同时设立M-MLV(-)对照。

反应体系中含有模板RNA,3′-CDS Primer,反应条件为70℃,2min,反应后立即冰上放置2min。然后加入下列组分:Reverse Transcriptase MMLV、5×First-Strand Buffer,DTT(20mmol/L)和dNTP(10mmol/L)继续反应,反应条件为42℃,90min,再加入100μL Tricine-EDTA buffer继续反应,反应条件为72℃7min。

1.2.6 PCR扩增

1.2.6.1 Outer PCR反应

按照TaKaRa公司的3′-Full RACE Kit的操作方法,配置含有LA Taq、3′RACE Outer Primer和上游外侧特异性引物F1的Outer PCR反应液,以反转录产物为模板进行Outer PCR反应。

1.2.6.2 Inner PCR反应

按照TaKaRa公司的3′-Full RACE Kit试剂盒的操作方法,配置含有LA Taq、3′RACE Inner Primer和上游外侧特异性引物F3的Inner PCR反应液,以Outer PCR反应产物为模板进行Inner PCR反应。取反应液5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.7 PCR产物纯化及测序

使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit,切胶回收目的产物,命名为CTC588-3P。将得到的产物送至宝生物(大连)有限公司测序。

2 结果与讨论

2.1 总RNA提取结果检测

在对目的基因进行3′RACE扩增时,需要以mRNA为模板,所以完整的mRNA结构是非常重要的。采用“1.2.4”的方法提取的菌体总RNA,取1μL进行3%琼脂糖凝胶电泳后,结果如图2所示。

从电泳凝胶结果看,提取的总RNA的28S和18S两条带较清晰,无拖尾。表明RNA降解较少,完整性很好,可以用于反转录。

对菌体总RNA进行紫外检测,A260为0.473,A280为0.241,A260/A280为1.96,该数值接近2.0,表明提取的RNA纯度比较好,基本无杂质污染。

2.2 3′RACE结果

采用“1.2.5”的方法进行cDNA的反转录合成,经过反转录反应和套式PCR反应后,得到反应液,取5μL进行3%琼脂糖凝胶电泳后,结果如图3所示。

图3 3′RACE产物和M-MLV(-)对照的琼脂糖电泳凝胶Fig.3 Agarose gel electrophoresis of product of 3′RACE and M-MLV(-)contrast

对PCR得到的产物切胶回收,经测序长度为258bp。

通过Clustal W软件比对后,可以确认扩增出的3′RACE的产物即是目的产物。其中编码区长度为122bp,非编码区长度为136bp。

2.3 序列验证

将3′RACE的产物序列与已知序列用Clustal W软件进行比对,结果如图4所示。

图4 3′RACE产物与CDS区已知序列使用Clustal w软件比对结果Fig.4 Contrast of product of 3′RACE and known sequence of CDS by Clustal w software

3 结论

根据薯蓣皂苷糖苷酶的CDS区已知序列,设计特异性引物,同时利用3′端特异性引物,并以菌种的总RNA为模板顺利扩增出cDNA3′末端的基因序列。3′RACE产物序列的总长度为258bp。将3′RACE的产物序列与已知序列用Clustal W软件进行了比对,确认扩增出的产物就是目的产物,其中编码区长度为122bp,非编码区长度为136bp,Poly A的长度为28bp。

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