RACE技术对薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA 3′末端的快速扩增
2010-09-26金凤燮鱼红闪
骆 宁，金凤燮，鱼红闪
（大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034）
0 引言
穿龙薯蓣，味苦性平［1］，含有丰富的薯蓣皂苷元。其根茎既是生产治疗心血管疾病药物的主要药源［2］，又是用于合成多种甾体激素类药物和避孕类药物的重要原料之一［3］。薯蓣皂苷经代谢产生的薯蓣皂苷元是发挥作用的真正有效成分，临床报道薯蓣皂苷元对治疗冠心病、康动脉粥样硬化、降血脂、平喘、抗炎和抗肿瘤都有一定的疗效［4］。研究显示，多糖基的薯蓣皂苷元在生命体中首先水解掉糖基，成为低糖基的薯蓣皂苷元才会被生命体所吸收发挥疗效，因此对薯蓣皂苷元的糖基进行水解是非常必要的。本实验室前期已经筛选出产薯蓣皂苷糖苷酶的Absidiasp.G3d菌，并且得到高活力的薯蓣皂苷糖苷酶，该酶能够特异性的水解薯蓣皂苷上的鼠李糖基，生成低糖基薯蓣皂苷元。
cDNA末端快速扩增技术即RACE技术（Rapid-Amplification of cDNA Ends），是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术［5］，是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5′和3′末端的有效方法［6］，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视［7］。本实验就是利用RACE技术，获得薯蓣皂苷糖苷酶cDNA 3′端的未知序列。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 菌 种
Absidiasp.G3d来源于大连工业大学生物与食品工程学院菌种保藏所。
1.1.2 培养基
察氏培养基，实验室自制液体培养基：40mL麸皮浸出液+60mL穿山龙浸出液，121℃高温高压灭菌后使用。
1.1.3 仪器与设备
HimacCF15R型高速冷冻离心机，JM-250型电泳仪，2816型快速离心机，PCR仪，紫外分析仪，UV-120-02型分光光度计，SK-1型快速混匀器，BCD-272AY型容声冰箱。
1.1.4 主要试剂
3′RACE cDNA Amplification Kit，RNAiso Reagent，LA Taq，DNaseI（RNase Free），RNase Inhibitor，DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；液氮由中国科学院大连化物所提供；苯酚、氯仿、异戊醇、乙醇等均购自天津科密欧化学试剂有限公司。
1.2 方 法
1.2.1 3′RACE试剂盒简介
本实验使用了3′RACE cDNA Amplification Kit，该试剂盒能够特异性的扩增cDNA 3′末端全长。其中含有Reverse Transcriptase M-MLV（RNaseH-），同时含有特异性引物：
3′RACE Adaptor Primer：含有dT区域及Adaptor Primer部分；
3′RACE Outer Primer：TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT；
3′RACE Inner Primer：CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG。
1.2.2 3′RACE试剂盒原理
进行3′RACE实验时，首先由Reverse Transcriptase M-MLV（RNaseH-）与3′RACE Adaptor Primer将Poly（A）+RNA反转录成cDNA，再使用TakaRa LA Taq及上游外侧特异性引物和3′RACE Outer Primer，以反转录的cDNA为模板，进行一次PCR反应。如果未能得到目的产物再使用上游内侧特异性引物和3′RACE Inner Primer进行二次PCR反应。（具体原理见图1）
图1 3′-Full RACE Kit试剂盒扩增cDNA 3′末端基因序列过程Fig.1 Procedure of amplification of 3′cDNA ends by 3′-Full RACE Kit
1.2.3 引物设计
根据已测定的薯蓣皂苷糖苷酶基因CDS区的已知序列设计特异性引物，同时考虑到真菌密码子的偏好性，设计出如下特异性引物：
上游外侧引物F1：5′-AACGCCTGCGGACT GGCGATCGCAAGG-3′27mers；
上游内侧引物F3：5′-CAACAAGGGTGCT TCGGGTGATT-3′23mers。
1.2.4 总RNA的提取
使用RNAiso Reagent提取米曲霉菌体总RNA，流程如下：
低温冻结的菌体→加入液氮研磨→加入适量的RNAiso Plus后匀浆→室温静置5min→加入1／5RNAiso Plus体积的氯仿→室温静置5min→12 000r／min 4℃离心15min→移至新离心管中加入等体积异丙醇→室温静置10min→12 000r／min 4℃离心10min→向沉淀中加入1mL的75%的乙醇→12 000r／min 4℃离心5min→弃上清，沉淀溶于适量的DEPC水中。取1μL进行3%琼脂糖凝胶电泳。
1.2.5 cDNA的反转录合成
反转录合成cDNA，同时设立M-MLV（-）对照。
反应体系中含有模板RNA，3′-CDS Primer，反应条件为70℃，2min，反应后立即冰上放置2min。然后加入下列组分：Reverse Transcriptase MMLV、5×First-Strand Buffer，DTT（20mmol／L）和dNTP（10mmol／L）继续反应，反应条件为42℃，90min，再加入100μL Tricine-EDTA buffer继续反应，反应条件为72℃7min。
1.2.6 PCR扩增
1.2.6.1 Outer PCR反应
按照TaKaRa公司的3′-Full RACE Kit的操作方法，配置含有LA Taq、3′RACE Outer Primer和上游外侧特异性引物F1的Outer PCR反应液，以反转录产物为模板进行Outer PCR反应。
1.2.6.2 Inner PCR反应
按照TaKaRa公司的3′-Full RACE Kit试剂盒的操作方法，配置含有LA Taq、3′RACE Inner Primer和上游外侧特异性引物F3的Inner PCR反应液，以Outer PCR反应产物为模板进行Inner PCR反应。取反应液5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。
1.2.7 PCR产物纯化及测序
使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit，切胶回收目的产物，命名为CTC588-3P。将得到的产物送至宝生物（大连）有限公司测序。
2 结果与讨论
2.1 总RNA提取结果检测
在对目的基因进行3′RACE扩增时，需要以mRNA为模板，所以完整的mRNA结构是非常重要的。采用“1.2.4”的方法提取的菌体总RNA，取1μL进行3%琼脂糖凝胶电泳后，结果如图2所示。
从电泳凝胶结果看，提取的总RNA的28S和18S两条带较清晰，无拖尾。表明RNA降解较少，完整性很好，可以用于反转录。
对菌体总RNA进行紫外检测，A260为0.473，A280为0.241，A260／A280为1.96，该数值接近2.0，表明提取的RNA纯度比较好，基本无杂质污染。
2.2 3′RACE结果
采用“1.2.5”的方法进行cDNA的反转录合成，经过反转录反应和套式PCR反应后，得到反应液，取5μL进行3%琼脂糖凝胶电泳后，结果如图3所示。
图3 3′RACE产物和M-MLV（-）对照的琼脂糖电泳凝胶Fig.3 Agarose gel electrophoresis of product of 3′RACE and M-MLV（-）contrast
对PCR得到的产物切胶回收，经测序长度为258bp。
通过Clustal W软件比对后，可以确认扩增出的3′RACE的产物即是目的产物。其中编码区长度为122bp，非编码区长度为136bp。
2.3 序列验证
将3′RACE的产物序列与已知序列用Clustal W软件进行比对，结果如图4所示。
图4 3′RACE产物与CDS区已知序列使用Clustal w软件比对结果Fig.4 Contrast of product of 3′RACE and known sequence of CDS by Clustal w software
3 结论
根据薯蓣皂苷糖苷酶的CDS区已知序列，设计特异性引物，同时利用3′端特异性引物，并以菌种的总RNA为模板顺利扩增出cDNA3′末端的基因序列。3′RACE产物序列的总长度为258bp。将3′RACE的产物序列与已知序列用Clustal W软件进行了比对，确认扩增出的产物就是目的产物，其中编码区长度为122bp，非编码区长度为136bp，Poly A的长度为28bp。
