果胶酶产生菌HDYM-02发酵条件的研究

平文祥，赵 丹，宋 刚，葛菁萍，凌宏志

(黑龙江大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080)

亚麻是天然纺织原料之一，亚麻纤维具有透气性好等优良性能，日益受到人们的喜爱。但在亚麻纤维中连接着大量的粘性物质(如果胶等)，为提取其中的可纺纤维，必须在一定程度上破坏它们的连接，即进行亚麻原茎脱胶。亚麻原茎脱胶的方法很多，主要有厌氧温水浸渍法和雨露法。雨露法受气候、降雨量和光照等条件的影响，多被西欧国家所采用。我国和前苏联主要采用的是温水浸渍法，俗称“沤麻”[1-2]，此法是利用麻茎及水源中微生物的自然发酵作用，产生果胶酶，它能将果胶分解成小分子还原糖，再通过DNS法[3-4]测定发酵液中还原糖的含量，间接反映菌株分解果胶能力的大小，该法被广泛用于生产。使用生物(酶)脱胶，既能减少环境污染、改善劳动条件和减轻对纤维的损坏，又能节约能量消耗，降低成本。针对此特点，对果胶酶产生菌HDYM-02进行了发酵条件的初步研究和探讨，并在实验室条件下确定其最佳培养方案，以期能为亚麻原茎生物(酶)脱胶的工业化生产服务。

1 实验

1.1 菌种来源

果胶酶产生菌HDYM-02，由巴彦县亚麻有限公司沤麻池中分离选育得到。

1.2 重要试剂

DNS试剂：将6.3g的3，5-二硝基水杨酸、262ml的2mol/lNaOH加到500ml含182g的酒石酸钾钠的热水溶液中，再加入5g苯酚及5g亚硫酸钠，待溶解、冷却后，加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，一周后即可使用。

1.3 培养基

1)种子培养基：液体牛肉膏蛋白胨培养基。

2)发酵培养基：果胶0.4%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，112℃灭菌30min。

1.4 方法

1)DNS法测定还原糖。取一定量的发酵液，6000rpm/min离心5min，再取离心上清液0.5ml移入加有0.5mlDNS试剂的试管，加4ml蒸馏水，摇匀，沸水浴中加热5min，迅速冷却。用分光光度计在540nm处测其吸光度值。参比液配制：离心上清液0.5ml与4.5ml蒸馏水充分混合[3]。

2)发酵种子液的制备。以两环的接种量将分离选育得到的菌株HDYM-02接种到种子培养液中，37℃静止培养24h。

2 结果与分析

2.1 温度对菌株HDYM-02分解果胶能力的影响

做温度试验时采用发酵培养基，分别考察了在29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃时，菌株分解果胶能力的大小，测定出发酵液中还原糖的含量，结果如表1所示：发酵温度试验表明，温度对本研究所筛选的菌株HDYM-02分解果胶的能力有显著的影响。从表1可以看出，当发酵液温度为33℃时，菌株HDYM-02产生的还原糖量最高，相对而言菌株繁殖也最快，；温度过高或过低，均不利于菌株HDYM-02的自身生长，并且产生的还原糖量相对低很多，所以发酵温度选择33℃为宜。

表1 温度对菌株分解果胶能力的影响

2.2 初始pH值对菌株HDYM-02分解果胶能力的影响

采用发酵培养基，进行了不同初始pH值的发酵试验，用1mol/ml的NaOH或HCl调节发酵液的初始pH值，分别考察了初始pH值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0时，菌株HDYM-02分解果胶的能力，结果如图1，图2所示：

图1发酵液初始pH值对菌浓的影响图2发酵液初始pH值对菌株分解果胶能力的影响

不同初始pH值的发酵试验结果表明，培养基初始pH值不同，对菌株HDYM-02发酵分解果胶能力有显著影响。在温度为33℃的时候，如图2所示，当发酵液的初始pH值为7.0时，菌株HDYM-02在各个时间点处分解果胶产生还原糖的量均较高，如图1所示，此时菌株的繁殖也较快。而当发酵液初始pH值小于7.0时，产还原糖量有所下降，相对菌浓变化也不明显，在发酵液初始pH值为4.5时，虽然还原糖产量在个别几个时间点时很高，但菌浓相对较低。所以控制发酵培养液的初始pH值为7.0时比较适宜。

2.3 氮源对菌株HDYM-02分解果胶能力的影响

在发酵培养基中，按照各培养基含氮量为0.1%，分别添加豆浆、(NH4)2SO4、尿素、(NH4)2CO3、NH4NO3各种氮源来代替蛋白胨，并以发酵温度33℃，初始发酵液pH值为7.0的条件对菌株HDYM-2进行发酵培养，结果如表2所示：尿素对菌株分解果胶的能力有显著的影响。其中,添加尿素对菌株分解果胶有利，还原糖产量相对较好，菌浓相对较高。另外，有机氮源比无机氮源更有利于还原糖的产生。

2.4 盐浓度对菌株HDYM-02分解果胶能力的影响

采用发酵培养基，进行了不同NaCl浓度的发酵试验，考察了NaCl浓度为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%时的还原糖产量，结果如表3所示：发酵试验结果显示，当盐浓度为0.5%～0.7%时，菌株HDYM-02分解果胶能力相对较强。但是，各盐浓度试验的还原糖产量差别不大，菌浓变化也不明显，说明盐浓度试验对菌株分解果胶能力的影响不显著。

表2 氮源对菌株分解果胶能力的影响

表3 盐浓度对菌株分解果胶能力的影响

2.5 正交试验

在以上单因子试验的基础上，选取对发酵影响较大几个因素，即发酵温度、发酵液初始pH值、尿素三个因子做L9(33)正交试验，试验设计方案见表4。

表4正交试验设计方案

连续发酵60h，试验结果如图3，图4所示。针对还原糖产量而言，图4显示：

1)0～6h时，各试验方案的发酵液中还原糖含量均处于上升阶段，其中方案3的还原糖含量相对较少，而方案5的还原糖含量最高，其余方案产还原糖量介于两者之间；

2)6～24h时，有的方案如方案8，还原糖产量有所下降，但总体而言仍呈上升趋势，到24h的时候，还原糖产量达到最大，在此阶段，方案3发酵液中还原糖含量相对较低，而方案9的含量相对较高；

3)24～48h时，各实验方案发酵液中的还原糖含量均处于下降阶段。针对还原糖产量下降的幅度而言，方案4下降的幅度最明显，方案2最缓慢，其余各方案还原糖量下降幅度介于两者之间；

4)48～60h时，发酵液中的还原糖产量有所上升。其中，方案9及方案2的发酵液中还原糖含量相对较高。

综合图3，图4分析，方案9发酵液中还原糖产量相对较高，菌株HDYM-02分解果胶的能力较强，相对的菌浓也较高，菌株HDYM-02繁殖较快，菌体长势较好。所以，笔者认为方案9为最佳发酵条件，最佳组合为A3B3C1，即菌株HDYM-02的最适发酵条件为：发酵温度35℃、发酵液初始pH值6.5、尿素浓度为0.5%。

图3 正交试验菌浓变化 图4 正交试验还原糖量变化

3 讨论

果胶酶属于诱导酶，菌株HDYM-02必须在果胶物质的诱导下才能产生原果胶酶，进而将果胶分解，产生还原糖。菌株HDYM-2不能利用或者很少利用果胶，在发酵培养基经112℃灭菌后，果胶由于物理(如压力、温度等)作用而少量分解成小分子还原糖，菌种正是利用该部分的还原糖，产生果胶酶，此时菌株处于产酶阶段，降解果胶生成还原糖，发酵液中还原糖含量增加。当分解代谢产物即还原糖量达到一定值时，该代谢物阻遏果胶酶的继续产生，酶合成终止，相对应的发酵液中还原糖含量也逐渐减少。随着分解代谢物的消耗，阻遏作用被解除，果胶酶生产恢复正常，发酵液中的果胶被逐步分解，发酵液中还原糖量再次上升。随着时间的延长，营养物质大量消耗，再加上菌株自身产酶能力的退化，使得菌种产酶量降低，其分解生成的还原糖量也相对减少，所以，发酵过程中虽然菌浓呈上升趋势，但产生的还原糖量却始终呈波浪型分布。

[参考文献]

[1] 于翠英,夏敬义.亚麻纺纱工艺学[M].哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,1997.

[2] Tang S W, Xiong HP.The present situation of the production of hemp, flax, etc. and their developmental strategies [J]. Sci&Technol Rev, 2000(3):44-46.

[3] 顾燕松.纺织生物助剂果胶酶酶活的测定方法[J].纺织科学研究,2002(3):29-34.

[4] 崔莉,张陈虎,钱国坻,等.果胶酶酶解产物DNS比色法测定条件的研究[J].印染,2002(12):32-35.

[5] 汪甫仁,陶熙春.生物酶在前处理加工中的应用[J].印染,2003,29(3):10-13.