青蛤受精和早期卵裂过程中核相的细胞学变化

董迎辉, 陈 杰, 林志华, 胡利华, 孙长森

（1. 浙江万里学院 生物与环境学院, 浙江 宁波 315100; 2. 浙江省海洋水产养殖研究所, 浙江 温州 325005;3. 台州学院 生命科学学院, 浙江 临海 317000）

青蛤受精和早期卵裂过程中核相的细胞学变化

董迎辉1, 陈 杰1, 林志华1, 胡利华2, 孙长森3

（1. 浙江万里学院 生物与环境学院, 浙江 宁波 315100; 2. 浙江省海洋水产养殖研究所, 浙江 温州 325005;3. 台州学院 生命科学学院, 浙江 临海 317000）

利用Hoechst 33258染色、荧光显微镜观察方法, 对青蛤（Cyclina sinensis（Gmelin））受精和早期卵裂过程中的核相变化进行了细胞学研究。结果表明: 青蛤成熟未受精卵呈圆球形, 核内同源染色体排列整齐, 核相处于第一次成熟分裂中期。在水温25～26℃条件下进行人工授精, 精卵混合后, 精子迅速附着于卵子表面; 受精后5～10 min, 精子进入卵内并明显膨胀成球形; 分别在10～15 min、20～25 min受精卵进行两次成熟分裂, 排出第一、第二极体; 30 min左右, 精、卵核体积膨胀, 形成弥散状的雌、雄原核; 35 min, 雌、雄原核在卵子中央发生原核联合, 染色体共同排列在纺锤体的赤道板上, 形成第一次有丝分裂的中期分裂相; 40～45 min, 受精卵进行第一次卵裂, 形成 2个大小不等的分裂球; 55～60 min, 第二次卵裂结束, 形成1大3小4个卵裂球, 卵裂过程中的核相变化与第一次卵裂基本相同;70 min左右, 胚胎开始第三次卵裂。另外, 在青蛤受精过程中发现了约1%的多精入卵现象, 且入卵精核均能形成雄原核, 但多精受精对成熟分裂和有丝分裂过程有很大影响, 往往造成成熟分裂紊乱和第一次卵裂染色体分离异常。

青蛤（Cyclina sinensis（Gmelin））; 受精; 早期卵裂; 多精入卵; 细胞学观察

青蛤（Cyclina sinensis（Gmelin））是中国南北沿海习见的经济贝类, 其肉味鲜美、营养丰富, 且有清热利湿、化痰散结之功效[1], 历来是沿海居民喜食的海鲜佳品。20世纪80年代, 青蛤的土池育苗[2]和室内人工育苗[3]相继取得成功, 育苗技术的突破与逐渐成熟为青蛤养殖业的快速发展奠定了坚实基础。加之青蛤具有生长快、适应性广和抗逆性强等优点, 在沿海滩涂具有广阔的养殖发展前景。有关青蛤的繁殖和发育的研究已经见诸报道, 如曾志南等[4～6]对青蛤的繁殖周期、卵母细胞发育过程及精细胞分化等进行了研究; 高悦勉等[7]用扫描电镜和透射电镜观察了青蛤精子的形态和超微结构; 孙晋廷等[2]、沈宝平等[8]用普通光镜对青蛤胚胎发育过程进行了观察和描述; 白胡木吉力图等[9]用常规石蜡切片方法对青蛤卵子的受精和第一次卵裂过程进行了研究。然而, 目前青蛤的规模化人工育苗技术并不稳定, 许多受精和发育机理尚不清楚, 亟需开展大量深入的基础研究。本实验采用荧光显微术对青蛤受精及早期胚胎发育过程中的成熟分裂、雌雄原核结合、早期卵裂等一系列细胞学事件进行了研究和探讨, 以期为青蛤受精机制的深入研究、规模化人工育苗以及细胞工程育种提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

实验于2009年6～7月在浙江省海洋水产养殖研究所清江科研基地进行。所用青蛤亲贝取自台州温岭, 壳高5～7 cm。荧光染色试剂盒Hoechst 33258（包括固定液、Hoechst荧光染料、抗淬灭剂）购自江苏碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

选择性腺饱满的青蛤亲贝, 雌性卵巢呈粉红色,雄性精巢呈乳白色或乳黄色。采用阴干、流水刺激结合升温的方法催产, 分别挑出刚产的雌、雄个体,经淡水冲洗后单个放入1 L的烧杯中, 加入600 mL过滤海水, 让其产卵、排精。选择镜检质量好的精、卵, 在水温25～26℃条件下进行人工授精和孵化。

从受精开始, 60 min内每隔 5 min取样一次,60～120 min, 每隔 10 min取样一次, 每次取卵量不少于1 000粒。样品用4%多聚甲醛溶液固定2次, 保存于4℃冰箱中。观察前先用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2）冲洗样品2～3次, 滴加Hoechst 33258荧光染料在黑暗环境下染色10 min, 再用磷酸缓冲液冲洗2次, 然后将卵液滴于载玻片上, 加1滴抗淬灭剂, 用盖玻片轻微压片, 在Nikon 80i荧光显微镜的紫外光（365 nm）下观察, CCD（Charge Coupled Device, 电荷耦合元件）图像采集系统拍照, 每个样品观察卵数为100粒。

实验重复3次。

2 结果

2.1 精卵形态和精子入卵

在荧光显微镜下, 青蛤成熟未受精卵呈圆球形,卵径 80～90 μm, 卵质被染成浅蓝色, 染色体呈亮蓝色, 此时核相处于第一次成熟分裂中期, 双价染色体粗短明显（图 1-1）。精子则仅能观察到头部浓缩的染色质发出亮蓝色荧光, 呈辣椒状, 约 3 μm 长（图1-2）。

在水温 25～26℃、pH8.0～8.2的条件下进行人工授精, 严格控制精卵比例。精、卵混合后, 精子迅速附着于卵子表面, 并逐渐斜插入卵膜, 入卵部位随机（图1-3）。受精后5 min左右, 精子的头部已经进入卵胞质中, 并明显膨大成直径5～6 μm的近球形结构（图 1-4）。

2.2 两次成熟分裂

精子入卵启动成熟分裂, 在受精后 10～15 min,受精卵进行第一次成熟分裂, 同源染色体在纺锤丝的牵拉下逐渐分开, 一组被拉向卵膜, 另一组拉向卵子中央（图1-5, 6）。靠卵膜的那组染色体逐渐向卵膜外拱, 最后经浓缩被排出卵膜之外, 形成第一极体, 从而完成第一次成熟分裂（图 1-7）。受精后20～25min, 留于卵内的那组染色体重新排列于赤道板上, 然后以同样的方式在第一极体下方发生第二次成熟分裂, 姐妹染色单体分离, 产生第二极体（图

1-8, 9）。

2.3 雌、雄原核的形成与结合

第二次成熟分裂完成以后, 卵子染色体开始膨胀扩散, 逐渐形成一团由核膜包围的、松散的染色质,即为雌原核。在此同时, 精核也发生第二次膨胀, 形成与雌原核大小、形状相似的雄原核。一般雌原核的位置靠近极体, 依此可区分雌、雄原核（图 1-9）。受精后 30 min左右, 多数雌雄原核体积达到最大,呈直径 13 μm×16 μm的椭圆形结构（图 1-10）。

雌、雄原核形成以后, 均向卵子中央迁移（图1-11）。受精后35 min, 两原核在卵子中央靠近, 但仍可看到中间的核膜（图 1-12）。随后二者的核膜破裂,染色质凝缩成两组染色体, 在卵子中央合并, 雌、雄原核以原核联合方式的结合（图 1-13～15）。联合核的染色体整齐地排列在与卵轴垂直的纺锤体的赤道板上, 形成有丝分裂的中期分裂相, 第一次卵裂行将开始（图 1-16, 17）。

2.4 早期卵裂

受精后40～45 min, 纺锤体微管将染色体拉向两极（图 1-18, 19）; 随着核分裂的进行, 卵细胞的外形在横向上被拉长, 然后自极体处发生纵向内缢, 形成十分明显的分裂沟, 将卵细胞分割成 2个大小不等的分裂球（图 1-20, 21）。第一次卵裂结束后, 两个分裂球中的染色体又变为染色质, 核膜重建, 进入有丝分裂的间期（图1-21）。

受精后50 min左右, 两个卵裂球中的染色体细丝逐渐螺旋变粗, 形成清晰可见的染色体, 核膜破裂, 染色体排列于纺锤体的赤道板上, 形成第二次有丝分裂中期的核相, 第二次卵裂开始（图 1-22～25）。第二次卵裂与第一次卵裂过程基本相同, 在与第一次卵裂垂直的纵轴方向上发生不等全裂, 其中大卵裂球的染色体分裂速度较快（图 1-26～28）。结果在受精后55～60 min, 卵裂基本结束, 形成3小1大4个卵裂球（图 1-29）。受精后 70 min左右, 胚胎开始第三次卵裂, 大卵裂球的染色体仍分裂较早（图 1-30～32）。

2.5 多精入卵与染色体异常分离

在受精后 10～15 min, 发现了约 1%的多精入卵现象, 入卵的精核都能解凝缩膨胀, 膨胀大小与单精入卵精核没有差别（图1-33）。受精后30 min左右,观察到大多数多精受精的卵子仅排出一个极体, 精核亦能发生原核化（图1-34）, 这表明青蛤多精入卵可以抑制成熟分裂进程, 而对精核的原核化过程没有太大影响。在随后的发育中, 虽然多个雄原核能与雌原核进行染色体联合, 但在第一次卵裂的核分裂过程中, 常因染色体不能均等分离而导致受精卵发育的失败（图1-35）。

图1 青蛤受精和早期卵裂过程中核相变化的荧光显微镜观察Fig. 1 Cytological observation of nuclear behavior of fertilization and early cleavage ofCyclina sinensisunder fluorescent microscope

3 讨论

3.1 成熟卵母细胞所处的发育时期和雌雄原核的结合方式

在水生动物中, 不同种类成熟未受精卵所处的发育时期不尽相同。海胆的成熟卵子已排出两个极体, 完成两次成熟分裂; 鱼类、两栖类的成熟卵已排出一个极体, 处于第二次成熟分裂中期; 甲壳动物及多数昆虫的成熟卵尚未排出极体, 处于第一次成熟分裂中期; 而双壳贝类卵子的成熟分裂还未开始,处于第一次成熟分裂的前期或中期。大多数双壳贝类如合浦珠母贝（Pinctada martensii）[10]、栉孔扇贝（Chlamys farrer）i[11]、泥蚶（Tegillarca granosa）[12]、菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）[13]、文蛤（Meretrix meretrix）[14]等受精前的卵母细胞核相处于第一次成熟分裂中期, 生发泡已经破裂, 粗短的双价染色体排列在纺锤体赤道板上, 而大西洋浪蛤（Spisula solidissima）[15]、近江牡蛎（Ostrea rivularis）[16]、太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）[17]、宽壳全海笋（Barnea dilatata）[18]等少数贝类受精前的卵母细胞处于第一次成熟分裂前期, 生发泡尚存在, 经过精子入卵的刺激后, 生发泡破裂并启动第一次成熟分裂。本实验观察到青蛤的成熟未受精卵呈圆球形, 生发泡已经破裂, 同源染色体形态清晰, 核相处于第一次成熟分裂中期, 与栉孔扇贝、文蛤等大多数双壳贝类相同。

贝类雌、雄原核的结合方式有原核联合和原核融合两种。一般认为, 受精前已完成成熟分裂的卵子,其两性原核以融合的方式结合; 而受精前尚未完成成熟分裂的卵子, 在受精后父本的染色体组需在卵内等待卵子完成成熟分裂, 雌雄原核在卵内重新出现后, 才各自独立形成染色体组, 以嵌合或联合的方式完成两性原核的结合[12]。已有的研究表明, 大多数双壳贝类如合浦珠母贝[10]、近江牡蛎[16]、太平洋牡蛎[17]、泥蚶[12]、菲律宾蛤仔[13]、文蛤[14]、宽壳全海笋[18]等受精前尚未完成成熟分裂, 雌、雄原核均以原核联合的方式结合, 即雌、雄原核相互靠拢时核膜不融合, 而以指状形式相嵌, 随后两原核都形成各自的染色体组, 待原核核膜消失后, 两组染色体联合起来形成合子染色体组。仅有栉孔扇贝等少数贝类雌、雄原核相互靠近后核膜融合, 染色质合并形成合子核。白胡木吉力图等[9]对青蛤受精卵的组织切片观察认为, 青蛤雌、雄原核融合成合子核, 以染色质融合的方式结合。然而, 由于组织切片技术方法的限制, 仅能对受精卵某一切面的核相进行观察, 难以观察到同时经过雌、雄原核的切面, 所以较难确定雌、雄原核的结合方式。相比之下, 荧光显微术能对整个受精卵的染色质变化进行多维观察, 有利于研究雌、雄原核的结合过程。本研究的结果发现, 青蛤的雌、雄原核在相互靠近、结合时仍然清晰可辨, 核膜不相互融合, 直到两原核都形成各自的染色体组,证明了其结合方式为原核联合。

3.2 贝类多精受精的主要成因和发生机理

贝类在正常受精的情况下, 一般为单精入卵、单精受精, 不仅可为卵子带来单倍体的遗传物质保持物种正常二倍体的细胞核, 而且还带入有丝分裂所必需的中心粒。然而, 在已有细胞遗传学研究的贝类中几乎都存在多精入卵现象[11～14,16～21], 其形成原因十分复杂, 可能与不同物种、精卵的成熟度、精卵比例等关系密切, 如鲍卵对多精受精的抵抗能力较强,即使精卵比例增加到 6.6×1041, 多精受精现象也没有增加[20]; 泥蚶卵对多精受精比较敏感, 精卵比例由2×1021上升到1×1031时, 多精入卵数明显增加, 畸形胚胎率和 D形幼虫率具有极显著的差异,达到2×1041时, D形幼虫率下降到1～4%; 利用太平洋牡蛎刚从卵巢中取出的卵子受精要比在海水中浸泡1 h后的卵子受精获得的多精入卵数多得多[19]。另外, 多精入卵还与受精时的环境条件如水温、pH等有关, 如近江牡蛎卵在受精时, 水温 25℃组的多精入卵现象明显比28.8℃组多[16]。由此可见, 在贝类人工育苗过程中要防止多精入卵和提高卵子的孵化率, 既要获得成熟度适宜的精卵并控制精卵比例,还要创造良好的外界受精条件。

海洋无脊椎动物阻止多精受精的策略通常有三:（1）阻止精、卵质膜融合; （2）改变卵膜结构, 阻止精子的附着或穿透; （3）即使造成多精入卵, 仅有1个精核与卵核融合[16]。海胆阻止多精入卵的机制主要包括:（1）快封闭反应: 精子进入卵细胞迅速触发膜电位改变, 引起膜外精子与卵细胞识别和融合障碍; （2）慢封闭反应: 通过皮层反应形成厚而硬的受精膜, 防范多余精子入卵[22]。然而, 对贝类阻止多精入卵的机制还不太清楚, 孙振兴等[23]推测皱纹盘鲍（Haliotis discus hainai）受精时也是通过卵膜电位的变化阻止早期入卵精子和皮层反应使后期到达精子失去活力。但有些贝类阻滞多精入卵的机制相对简单和不完善, 如扇贝的卵黄膜薄, 其外无胶膜层, 卵黄膜举起形成受精膜时, 结构和厚度基本无变化, 故不能有效阻止多精入卵的发生[24]。在青蛤的受精过程中,也发现了极少量的多精入卵现象, 至于其主要通过何种途径阻止多精入卵, 尚待开展进一步研究。

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Received: Mar., 24, 2010

Key words:Cyclina sinensis; fertilization; early cleavage; polyspermy; cytological observation

Abstract:The artificial insemination experiment ofCyclina sinensiswas carried out three times at Qingjiang Field Research Station of Zhejiang Mari-culture Research Institute from June to July in 2009. More than 1000 fertilized eggs and early embryos ofC. sinensisin every developmental stage were fixed by 4% paraformaldehyde and stained by Hoechst 33258 to study the changes of nuclear behavior under the fluorescence microscope. The results of cytological observation indicated that unfertilized mature eggs ofC. sinensiswere globular （80～90 μm in diameter） and remained at the metaphase of the first maturation division. At water temperature of 25～26℃, artificial insemination was conducted. After mixing of sperms and eggs, sperms quickly attached to the surface of the eggs.At 5～10 min after fertilization, sperm has penetrated into cytoplasm of egg and activated the maturation division.The fertilized eggs released the first polar body at 10～15 min and the second polar body at 20～25 min. At about 30 min, sperm nucleus and the haploid female nucleus expanded to their maximum and developed into the male and female pronuclei which were loose and incompact. At 35 min, the male and female pronuclei matched into an association nucleus after their chromosomes formed in the center of egg. Subsequently, the chromosomes of association nucleus arranged on the metaphase plate of first cleavage. At 40～45 min, the chromosomes were separated equally into two daughter cells which were different in size. At 55～60 min, the second cleavage finished and formed four daughter cells, one big and three small. The process of the second cleavage was fundamentally similar to the first cleavage. At about 70min, the third cleavage started. In addition, the abnormal polyspermy about 1% in the process of fertilization was also observed. Though the polyspermy did not affect the formation of male pronucleus, it significantly affected the process of the maturation division and mitotic division as result of abnormal chromosome division.

（本文编辑:梁德海）

Cytological change of nuclear behaviors of fertilization and early cleavage in Cyclina sinensis

DONG Ying-hui1, CHEN Jie1, LIN Zhi-hua1, HU Li-hua2, SUN Chang-sen3
（1. College of Biological and Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China;2. Zhejiang Mari-culture Research Institute, Wenzhou 325005, China; 3. College of Life Sciences, Taizhou University, Linhai 317000, China）

S917.4

A

1000-3096（2010）12-0040-06

2010-03-24;

2010-07-15

浙江省科技厅面上农业项目（2009C32020）; 浙江省自然科学基金项目（Y3090007）; 台州市科技计划项目（08KY07）

董迎辉（1980-）, 男, 河南洛阳人, 博士生, 研究方向为海洋贝类发育生物学和遗传育种学, E-mail: dongyinghui118@126.com; 林志华,通信作者, 博士, 研究员, 主要从事海洋经济贝类遗传育种研究, E-mail:zhihua9988@126.com