碱性成纤维细胞生长因子在大鼠哮喘气道重塑模型中的表达及地塞米松的干预作用

巩雪芳 薄建萍 陈俊艳

大量的研究证明许多成纤维细胞因子(fibroblast growth factors，FGFs)在慢性炎症和组织重塑进程以及慢性气道疾病如哮喘的纤维化中起作用[1]。碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是FGFs庞大家族中的一员，而且是在哮喘病理生理学中研究最多的一员。这个生长因子最早在牛垂体抽提物中发现，基于其刺激成纤维细胞细胞株NIH3T3增殖的能力及其高等电点(PI=9.6)而得名[2]。它在血管发生过程中血管内皮、平滑肌细胞的增殖，损伤愈合过程中成纤维细胞的迁移和增殖，成肌纤维细胞表型的逆转，以及气道上皮细胞的迁移和增殖中起作用[3]。本文通过观察在不同程度气道重塑情况下血清中bFGF含量的变化，探讨bFGF与气道重塑严重程度的相关性及地塞米松干预的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 彩云JWC-201D型超声雾化器：鞍山市同信医用仪器厂；BH-2型光学显微镜：日本Olympus公司；LY-SUPER HP CCD万能成像装置：成都励扬精密机电有限公司；80-2B型低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；ZS-2板式酶标仪：北京新风机械厂；IMS6.0彩色图像分析系统：上海申腾信息技术有限公司。

1.1.2 试剂 卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)：美国Sigma公司；氢氧化铝(Aluminum hydroxide，Al(OH)3)：天津化学试剂三厂；bFGF ELISA试剂盒：美国R&D systems公司。

1.1.3 动物 雄性Wistar大鼠40只，2～3月龄，体重160～180g，清洁级，购于河北医科大学实验动物中心，室温20℃饲养，自由进食与饮水。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 按随机数字表法将40只大鼠分为早期干预组(early-intervention group)、晚期干预组(lateintervention group)、不干预组(non-intervention group)及对照组(control group)，每组10只。

1.2.2 模型建立 实验第1天，E组、L组和N组每只大鼠腹腔注射10%卵白蛋白抗原混悬液(内含生理盐水加卵蛋白100mg，氢氧化铝干粉100mg)1ml致敏；C组腹腔注射等量生理盐水。8天后E组、L组和N组每只大鼠再次腹腔注射10%抗原混悬液1ml；C组腹腔注射等量生理盐水。第15天，E组、L组和N组开始用1%卵蛋白超声雾化吸入激发哮喘，每天1次，每次20min，共8周；C组用生理盐水雾化吸入，每天1次，每次20min，共8周。其中，E组在每次雾化前1h，每只大鼠首先腹腔注射地塞米松0.5mg/kg；从雾化第15天始，L组在每次雾化前1h，每只大鼠首先腹腔注射地塞米松0.5mg/kg；C组用生理盐水代替，注射剂量相同。

1.2.3 标本制备 每只大鼠于最后一次雾化后24h内用10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉，开胸，右心室取血约2ml，于室温放置2小时后，1000r/min，离心10min，取上清液分装，-20℃保存待测。同时，取右肺中叶，4%多聚甲醛溶液中固定1周，常规石蜡包埋，切片，做HE染色。

1.2.4 图像分析 HE染色切片上100倍光镜下选择完整支气管横断面测量支气管基底膜周径(Pbm)、支气管总面积(At)、管腔面积(Ac)、平滑肌外缘内气管面积(AMe)、平滑肌内缘内气管面积(AMi)。

计算公式：

支气管壁厚度=(At-Ac)/Pbm

平滑肌厚度=(AMe-AMi)/Pbm

衡量气道重塑程度[4]。

1.2.5 检测血清bFGF水平 使用ELISA法，按试剂盒说明测定血清中bFGF浓度值。

1.2.6 统计学分析 用SPSS16.0统计软件分析。多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，两个变量间的关系采用线性相关分析，结果用(±s)表示，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 一般情况观察 N组、E组、L组大鼠初次雾化结束时即出现大汗淋漓，口唇轻度紫绀，腹部翕动，烦躁不安，易激惹，饮水增加。C组大鼠行动敏捷，未见异常。

2.2 计算机图像分析

2.2.1 HE染色形态学改变 N组肺组织中支气管上皮细胞脱落，支气管黏膜皱襞增多，中断，呼吸道壁增厚，管腔狭窄，黏膜下、管壁及肺泡间质均见有大量炎性细胞浸润(以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主)；E组支气管上皮结构基本正常，上皮细胞偶有脱落，黏膜相对完整，呼吸道壁增厚及炎症细胞浸润均明显轻于N组；L组的变化介于上述两组之间；C组肺组织中几乎无上述病理改变。

2.2.2 各组大鼠支气管管壁厚度和平滑肌厚度测定(表1)

2.3 血清中bFGF浓度(见表2，3)

2.4 统计学分析结果

2.4.1 各组大鼠支气管管壁厚度和平滑肌厚度比较 各组大鼠支气管壁厚度数据由方差分析得F=518.49，P＜0.01；进一步经LSD-t检验，任何两组间支气管壁厚度上的差异均有统计学意义(P＜0.05)。同样，各组大鼠气道平滑肌厚度数据由方差分析得F=271.26，P＜0.01；进一步经LSD-t检验，任何两组间支气管壁厚度上的差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.4.2 各组大鼠血清中bFGF浓度比较 由方差分析得F=132.70，P＜0.01；进一步经LSD-t检验，任何两组间血清中bFGF浓度上的差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.4.3 各组大鼠血清中bFGF浓度与支气管壁厚度及平滑肌厚度之间的关联性分析 绘散点图知，血清中bFGF浓度与支气管壁厚度呈线性趋势，Pearson相关系数r=0.93(t=6.16，P＜0.001)，表明血清中bFGF浓度与支气管壁厚度间呈线性正相关；同样，绘散点图知，血清中bFGF浓度与平滑肌厚度也呈线性趋势，Pearson相关系数r=0.95(t=18.75，P＜0.001)，表明血清中bFGF浓度与平滑肌厚度间也呈线性正相关。

表1 各组大鼠支气管壁及平滑肌厚度(μm，±s)

表1 各组大鼠支气管壁及平滑肌厚度(μm，±s)

分组 n 支气管壁厚度 平滑肌厚度N组 10 139.34±5.80 36.93±1.52 E组 10 101.53±2.33 22.22±1.32 L组 10 117.77±1.20 29.24±0.97 C组 10 80.19±2.79 18.47±2.19

表2 各组大鼠血清中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的浓度(±s，ng/ml)

表2 各组大鼠血清中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的浓度(±s，ng/ml)

分组 n 血清中bFGF含量(ng/ml)N组 10 0.53±0.04 E组 10 0.34±0.02 L组 10 0.43±0.03 C组 10 0.30±0.03

表3 各组大鼠血清中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)浓度的变异度

3 讨论

哮喘气道重塑最重要的病理变化是上皮剥脱、杯状细胞化生、上皮下肥厚、气道平滑肌增生、支气管腺体肥大、血管生成和细胞外基质(ECM)成分改变[5]。在这些病理变化中，气道平滑肌增生是哮喘气道重塑最显著的特征[6]。有研究表明，bFGF诱导哮喘气道平滑肌增生[2]，通过增加人气道平滑肌细胞增殖和迁移、改变其收缩性表型在哮喘气道重塑中起重要作用[1]。本实验中，从早期干预组、晚期干预组至不干预组，气道重塑程度(支气管壁厚度、平滑肌厚度)逐渐增加，而bFGF浓度也呈上升趋势，提示bFGF与哮喘气道重塑严重程度相关，经统计学分析，两者呈线性正相关，由此推测bFGF未来可能成为评价气道重塑程度、诊断和治疗哮喘气道重塑的关键因子。在哮喘治疗中糖皮质激素是最有效的抗炎药物[7]，在本实验中，应用地塞米松后，早期干预组气道重塑程度明显较晚期干预组及不干预组为轻，提示早期地塞米松治疗可部分逆转哮喘气道重塑，其可能通过下调bFGF起作用。另外本实验中，早期应用地塞米松效果明显，可预见用药时机的选择是治疗哮喘气道重塑的关键之一，在未来可考虑检测哮喘患者血清bFGF来指导临床用药，从这个意义上来说，本实验可作为一个初步参考，一个因子要作为诊断标准还需进行大量临床工作，且本实验为动物实验，要在人群中明确bFGF是否为哮喘气道重塑的关键因子也需要进一步的临床研究。

[1]Zou Hui,Nie Xiu-hong,Zhang Yi,et al.Effect of basic fibroblast growth factor on the proliferation,migration and phenotypic modulation of airway smooth muscle cells[J].Chin Med J,2008,121(5):424-429.

[2]Ynuk Bossé,Marek Rola-Pleszczynski.FGF2 in asthmatic airwaysmooth-muscle-cell hyperplasia[J].Trends Mol Med,2007,14(1):3-11.

[3]Seong Gyu Jeon,Chun Geun Lee,Min-Hee Oh,et al.Recombinant basic fibroblast growth factor inhibits the airway hyperresponsiveness,mucus production,and lung inflammation induced by an allergen challenge[J].J Allergy Clin Immunol,2007,119:831-837.

[4]王传夏,李昌崇,罗运春,等.支气管哮喘大鼠气道重塑中肺泡巨噬细胞的作用[J].中华结核和呼吸杂志,2006,29(11):740-743.

[5]Thais Mauad,Elisabeth H.Bel,Peter J.Sterk.Asthma therapy and airway remodeling[J].J Allergy Clin Immunol,2007,120:997-1009.

[6]Etsuko Tagaya,Jun Tamaoki.Mechanisms of Airway Remodeling in Asthma[J].Allergol Int,2007,56:331-340.

[7]David H,Broide.Immunologic and inflammatory mechanisms that drive asthma progression to remodeling[J].J Allergy Clin Immunol,2008,121:560-570.