黄曲霉毒素P1的高效液相色谱测定

涂文升

广西肿瘤防治研究所药剂科（530021）

黄曲霉毒素P1（AFTP1）是黄曲霉毒素B1（AFTB1）的代谢产物，据文献报道：给恒河猴经腹腔注射AFTB1，尿中主要代谢产物为葡萄糖醛酸代谢产物，经β葡萄糖醛酸水解后，经鉴定主要为AFTP1，占恒河猴尿中黄曲霉毒素衍生物的60%[1]。为了进一步研究AFTB1经人体代谢后的产物AFTP1，特建立AFTP1的高效液相色谱测定方法。

1 仪器与试药

日本岛津高效液相色谱仪：包括LC-10AT泵、RF-530荧光检测器、威玛色谱数据工作站、CTO-10A柱温箱等，上海安亭科学仪器厂TGL-16B型离心机，上海精科实业有限公司XW-80型旋涡混合器。

甲醇为色谱纯，三氟醋酸（进口分装）、乙醇、醋酸铅均为国产分析醇，AFTP1对照品为美国Sigma公司产品。

2 色谱条件

分析柱：Shim-pack CLC-ODS C18（5.0mm×150mm，5μm），流动相：无水乙醇，流速：0.75mL/min，柱温：45℃，检测波长：EX：365nm，EM：435nm，灵敏度：1。

3 方法与结果

3.1 AFTP1对照品溶液的制备

精密称取AFTP150μg，置于5.0mL的量瓶中，加入一定量的甲醇，在旋涡混合器上充分混合溶解后，加甲醇至刻度，即为10.0ng/μL的标准品溶液。

3.2 样品溶液的制备

取头一天进食过花生食品的健康人的尿液9.0mL，加入过饱和的醋酸铅溶液1.0mL摇匀，用快速定性滤纸过滤，滤纸用少量氯仿洗涤，滤液转移至25.0mL的比色管中，加入氯仿在旋涡混合器上提取3次（10.0、10.0、5.0mL），收集氯仿提取液，水浴挥干，残渣用1.0mL无水乙醇溶液，转移至1.5mL的离心管中，离心10min（15000r/min），上清液即为样品溶液。

3.3 线性范围的考察

取上述“3.1”的标准品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5μL进样，按上述色谱条件测定，以AFTP1的进样绝对量为纵坐标（Y），AFTP1峰面积为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程为：137 177.4-11 3625.8Xr=0.9 996 线性范围25～125ng。

3.4 精密度试验

取上述样品溶液5.0μL，连续进样5次，记录峰面积，RSD=2.14%。

3.5 重现性试验

精密取经测定不含AFTP1的尿液9.0mL，共5份，精确加入AFTP110.0μL，以下按“3.2样品溶液加入过饱和的”后的步骤操作，进样5.0μL，RSD=1.85%。

3.6 稳定性试验

样品溶液在室温、避光条件下放置，在上述色谱条件下于0、1、3、5d分别进样5.0μL。记录峰面积，RSD=2.14%。结果表明在120h内基本稳定。

3.7 加样回收率试验

精密取经测定不含AFTP1的正常人尿液9.0mL，共12份，分别精密加入上述标准品溶液5.0、5.0、5.0、10.0、10.0、10.0、20.0、20.0、20.0μL，以下按“3.2样品溶液加入过饱和的”后的步骤进行，测定结果见表1。

图1 色谱图

表1 加样回收结果（n=3）

3.8 尿样测定

在上述选定的色谱条件下，取“3.2”样品溶液5.0μL，测定其AFTP1含量（外标法），测定结果，AFTP1 为129.80μg/L，色谱图见图1。

4 讨 论

黄曲霉毒素的HPLC测定的报道较多，尤其是AFTB1及AFTM1，一般都是经过三氟醋酸衍生化后再测定，这样荧光强度更强，有利于微量或痕量样品的检测[2,3]，而AFTP1的HPLC测定尚未见报道，本文经过衍生化和没有衍生化的对比处理测定，结果色谱的峰高和/或峰面积差异不大，而不经过衍生化直接进样测定，更简单、快速，并且同样能达到微量测定的要求。

AFTP1是AFTB1经过体内代谢后经尿排出的一种代谢产物，所以进行了尿中的回收率测定研究，同时还进行了尿样的测定，结果比较理想，达到了实验设计的要求，为今后进一步研究AFT高摄入地区居民尿中的AFTP1含量提供了实验参考和技术支持。

尿中各种代谢产物繁多，为了减少对色谱柱的污染，延长色谱柱的使用寿命，同时也避免其对AFTP1测定主峰的干扰，在样品的前处理时，加入10%的过饱和醋酸铅溶液沉淀，过滤后再进行AFTP1的提取，使其他干扰物质减少到最低限度[4]。

[1]孟昭赫,张国柱,宋圃菊.真菌毒素研究进展[M].北京：人民卫生出版社出版,1979：108.

[2]涂文升,刘宗河,莫林华等.广西肝癌高低发区儿童摄入黄曲霉毒素B1与尿中排出黄曲霉毒素M1的关系研究[J].中华预防医学杂志,1993,27(4)：218.

[3]涂文升,刘宗河,谢重华等.树摄入黄曲霉毒素B1后尿中黄曲霉毒素M1排出水平的研究[J].广西医学院学报,1989,6(3)：59.

[4]Liu ZH,Tu WS,Li DR,et al. A New Methodfor the Quantitation of Aflatoxin M1Urine by High Performance Liquid Chromatography and Its Appliction to the Etiologic Study of Hepatoma[J]. Bio Chromatoghapy,1990,4(2)：83.