霍奇金淋巴瘤与EB病毒感染的相关性研究

郑雄伟 林晋 林贤东 陆俐丽 力超

福建医科大学教学医院，福建省肿瘤医院病理科,福建 福州 350014

近年来，流行病学、分子生物学及免疫学等方面的研究认为EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染与多种肿瘤有关，如胃癌、乳腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤和鼻咽癌等疾病［1］，其中Burkitt’s淋巴瘤和鼻咽癌与EBV的密切相关性已被公认［2］。已有研究表明，EBV感染与霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL）的关系较为密切，但在不同地区、性别及不同年龄之间，HL组织中EBV的检出率存在着差异［3］。本研究采用组织芯片技术结合原位杂交方法对福建地区74例HL EBV感染的情况进行观察，并了解EBV相关HL在本地区的特点。

1 资料和方法

1.1 资料 收集福建省肿瘤医院2003年—2009年间经病理确诊的74例HL石蜡包埋标本，所有病例均按WHO2008年淋巴瘤新分类标准分类。

1.2 组织芯片的制作 组织芯片由上海芯超生物科技有限公司、生物芯片上海国家工程研究中心制备。所有供体组织蜡块行常规病理切片后做HE染色，病理专家作2次诊断，并在HE切片上根据典型病理部位作标记。阵列制作利用组织芯片制作仪（Beecher Instruments Inc.）在受体蜡块（空白蜡块）上打孔（直径1.0 mm），然后根据HE片上精确范围在供体组织蜡块相应位置获取所要的1个组织芯片放入受体蜡块阵列孔中，并记录组织编号，重复上述步骤制成阵列块1块（98点）。采用切片机（英国Shandon公司）以4 μm进行连续切片制成组织芯片切片，所得的组织芯片的每个点都经过病理诊断。

1.3 原位杂交法检测病变组织内EBER表达情况 试剂盒采用福建泰普生物科学有限公司的EBER探针原位杂交检测试剂盒（S30173），具体操作步骤参照试剂使用说明书。简述如下：切片脱蜡，梯度酒精水化，蛋白酶K消化5 min。蒸馏水洗，梯度酒精脱水，室温下干燥，加EBER探针，湿盒内置55 ℃温育90 min，转置37 ℃温育过夜，PBS冲洗。加过氧化物酶，室温温育10 min，PBS冲洗。加地高辛抗体， 室温温育60 min，PBS冲洗。滴加增效剂，室温温育20 min，PBS冲洗。滴加辣根过氧化物酶抗体，室温温育30 min，PBS冲洗。然后DAB显色，苏木精复染，光镜观察结果。用试剂盒所附的阳性片作阳性对照，用PBS代替EBER探针作阴性对照。

1.4 原位杂交结果判断 HL瘤细胞以双核或多核瘤巨细胞为特征，核膜厚，核中央有大的嗜酸性核仁，以双核面对面排列的经典Reedsternberg细胞（R-S细胞）为代表。以肿瘤细胞核内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，以整张组织切片中出现5个以上阳性肿瘤细胞者为阳性病例，少于5个阳性细胞者为阴性病例。

1.5 统计处理 采用SPSS 11.1软件进行统计处理，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床特点 在74例淋巴瘤患者中，男性53例，女性21例，年龄8～82岁，平均年龄35.9岁，其中1～14岁10例，15～69岁56例，≥70岁8例，均发生在淋巴结内（颈部淋巴结54例，腋窝淋巴结7例，锁骨淋巴结13例）。组织分型：4例为结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤（nodular lymphocyte-predominant HL，NLPHL），70例为经典型HL（classical Hodgkin’s lymphoma，CHL），其中LP为17例、MC为28例、NS为18例、LD为7例。

2.2 EBER阳性的定位分布 原位分子杂交检测EBER被认为是检测肿瘤细胞EBV的金指标，EBER阳性表达定位在R-S细胞核上，呈棕褐色（图1）。

2.3 不同性别及年龄患者HL与EB病毒感染情况 根据HL患者的年龄的不同分为3组［1-2］：儿童组（≤14岁）、成人组（＞14～＜70岁）和老年组（≥70岁）；在儿童组中10例有9例EBV表达阳性，老年组中8例有7例EBV表达阳性，与成人组（39.3%，22/56）相比，差异具有统计学意义（χ2=13.4，P＜0.05）。在55例HD男性患者中，EBER阳性病例29例，占男性病例的54.7%；在21例HD女性患者中，EBER阳性病例9例，占女性病例的42.7%。男女比例为1.3∶1。经统计分析，性别间EBER检出率差异无统计学意义（χ2=0.059，P=0.357）。

图1 EBER原位分子杂交显示肿瘤性RS细胞核呈阳性Fig.1 EBER in situ hybridization for HL cases showed positive signals in nuclear or nucleolar regions of RS cells (arrow mark).

2.4 HL各组织学类型EBV感染情况 74例HL中，38例EBER阳性病例中，其中LP有5 例（5/17，29.4%）；MC有23例（23/28，82.1%）；NS有5例（5/18，27.8%）；LD有5例（5/7，71.4%）; NLPHL为0例（0）。MC和LD的EBV阳性率明显高于其他类型，差异具有统计学意义（χ2=23.3，P＜0.05）。

2.5 临床分期与EB病毒感染情况 在38例EBER阳性病例中，其中临床分期为Ⅰ～Ⅱ期有11例（阳性率33%，11/32），临床分期为Ⅲ～Ⅳ期有27例（阳性率76%，27/42），Ⅲ～Ⅳ期患者EBV阳性率明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异具有统计学意义（χ2=7.7，P＞0.05）。.

3 讨 论

EBV感染与HL的关系在世界很多地方都有研究，Weiss等［4］首次报道在HL组织中检出EBV-DNA，其检出率为20%～25%，后来运用免疫组化以及更敏感的EBER原位杂交的方法，检测到R-S细胞内的EBV病毒的存在，进一步证实了EBV与HL之间的关系［5］。各国所报道的HL中EBV的检出率有很大的差异，日本为65%，美国为50%左右［6-7］，我国报道为48%～57%［8］。Diepstra等［2］的研究显示，HL患者EBV阳性率与组织分型有关，在HL各型中MC型明显高于其他类型。本研究结果显示，利用EBER原位杂交技术HL中EBV的检出率为52%，说明EBV感染在HL的发生中起着重要的作用。在经典型HL各型中EBV的检出率以LD型和MC型为高，LD病例组中7例有5例为阳性，MC病例组中28例有23 例为阳性，而NS 病例组中18例只有5例为阳性，LP病例组中17只有5例为阳性。说明本地区经典型HL各型中MC型与EBV关系最密切，其次是LD型，NS型的感染率最低，而NLPHL几乎与EBV无关。

EBV阳性的HL在人群中的分布不均匀，有研究表明男性患者的EBV阳性率高于女性患者，儿童与老年HL患者EBV感染比成人HL高［5-6］，我们的研究显示，男性HL的EBER阳性率为54.7%（29/55），女性HL的EBER阳性率为42.7%（9/21），男女比例为1.3∶1与文献结果相符［6］，Zhou等［8］对中国104例儿童HL和52例成人HL的EBV感染进行分析，发现89%儿童HL和38%成人HL有EBV感染。本研究利用EBER原位杂交技术发现≤14岁儿童组及≥70岁老年组的EBV阳性率很高，在儿童组中10例有9例EBV表达阳性，老年组中8例有7例EBV表达阳性，而成人EBV阳性率则为39.3%（22/56），两者之间存在显著性差异（P＜0.05）。同时，儿童和老年组HL患者EBV的感染率显著高于成年患者，出现这些现象的原因可能是与儿童及老年人免疫能力相对低下、环境因素及人体基因易感性有关［9-10］。

EBV感染与HL患者的临床分期还存在分歧。Kwon等［9］在韩国HL患者的研究结果显示，Ⅲ～Ⅳ的HL患者EBV阳性率为86.7%（13/32）明显高于Ⅰ～Ⅱ患者（13.3%，2/24）［9］，与我们的研究结果相一致。同时他们研究还显示，EBV阳性率患者的生存期较EBV阴性患者而言有缩短的趋势。EBV阳性率的患者还常伴随B症状。然而，Jarrett等［11］在研究英国苏格兰HL患者对却得到相反的结果。这可能因为EBV感染有地域依赖性。

综上所述，福建地区HL的发病与EB病毒的感染有较为密切的关系，但其致病机制目前仍不明了，目前研究认为EBV的可能致病机制是［12］：⑴EBV感染使淋巴细胞染色体发生突变或易位，导致c-myc癌基因激活和过度表达，最终导致淋巴瘤的发生；⑵由于EBV感染使淋巴细胞系中Fas介导的细胞凋亡受抑以及凋亡抑制基因Bcl-2表达异常，淋巴细胞凋亡受抑而发生淋巴瘤，这可能是B细胞相关的经典HL的主要病因。

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