超临界CO2流体萃取莪术油的工艺研究

王 娟 刘汉清

1 郑州市第二人民医院药剂科（450000）

2 南京中医药大学（210046）

莪术为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val.、广西莪术Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C.F. Liang或温郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling的干燥根茎。现代研究表明，莪术挥发油具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、抗氧化和保肝等活性，其抗肿瘤活性物质主要为莪术醇（Curcumol）、榄香烯（Elemene）、牦牛儿酮（Germacrone，即吉马酮）、莪术酮（Curzerenone）等[1]。超临界CO2萃取（supercritical fluid extraction，SFE）技术是一项集提取、分离、浓缩为一体的新技术，其工艺优越，质量稳定，能保持传统中医的用药效果，适合工业化大生产的需要。故本试验采用GC、HPLC法测定莪术挥发油中主要抗癌活性成分莪术醇、牦牛儿酮的含量，并以次为指标对莪术的CO2超临界流体萃取工艺条件进行了正交设计试验研究。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

莪术药材（购自南京市药材公司，经本校中药鉴定教研室鉴定为）；莪术醇（中国生物鉴定所，批号：100185-200405）；牦牛儿酮标准品：中国药品生物制品检定所，批号111665-200801；CO2（纯度99.9%，南京特种气公司）；其他试剂皆为市售分析纯。

1.2 仪器设备

气相色谱仪：美国安捷伦仪器公司，型号Agillent 4890；色谱柱：HP-35毛细管柱。

液相色谱仪：SPD-10Avp检测器；岛津LC-10ADvp泵；SDC-15恒温柱温箱；HW-2000色谱工作站；CT-21色谱信号采集单元。

超临界流体萃取装置（南通华安超临界萃取有限公司，型号HA221-50-06）：萃取柱容积为1L，最高萃取压力为50MPa，最高萃取温度为75℃，最大流量为50L/h可调。设备的萃取流程为一级萃取，二级分离。萃取操作在设定萃取操作参数后，由程序控制萃取及分离操作的压力和温度。

分析天平FA1104：上海天平仪器厂。

2 试验方法

2.1 莪术醇含量测定方法建立[2-4]

2.1.1 色谱条件

Agilent 4890气相色谱仪；HP-35毛细管柱；程序升温：柱温140℃，保持10min，以5℃/min升温至170℃，保持1min，再以20℃/min升温至200℃，保持1min；气化室温度250℃；FID检测器温度250℃；柱前压10psi；载气高纯N2；进样量1μL。柱效以莪术醇计算，理论塔板数n=2000/m，分离度＞1.5。

2.1.2 莪术醇标准品溶液的配制

精密称取莪术醇标准品加乙醚制成168.4μg/mL的溶液为标准储备液。

2.1.3 莪术挥发油样品溶液的制备

精密称取各样品约50mg至5mL容量瓶中，乙醚定溶至刻度，0.45μm微孔滤膜滤过后，按2.1.1项下的GC色谱条件，1μL样品进样，测定莪术醇含量，并计算莪术醇在莪术油中所占的百分比。

2.1.4 线性范围的测定

从标准储备液中分别精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，乙醚定溶至1mL，配成不同浓度的系列标准液。每种浓度进样1μL，连续进样3次取峰面积的平均值，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，线性方程为：A=46.814C-582.26（r=0.9993）。结果表明：莪术醇质量浓度在33.68～168.4μg/mL范围内呈良好线性关系，见表1。

2.2 牦牛儿酮的含量测定方法的建立[5]

2.2.1 色谱条件

色谱柱：HederaODS-3（250×4.6mm，5μm）；检测波长为210nm；流速为0.8mL/min；流动相：甲醇-水（85∶15）。

2.2.2 牦牛儿酮对照品储备液的配制

表1 莪术醇线性范围测定结果

表2 牦牛儿酮线性范围测定结果

表3 正交试验设计因素与水平表

表4 正交试验结果（n=3）

牦牛儿酮对照品储备液：精密称定牦牛儿酮对照品加甲醇制成508μg/mL的溶液作为标准储备液。

2.2.3 莪术挥发油样品溶液的制备

精密称取各样品约20mg至10mL容量瓶中，甲醇定溶至刻度，0.45μm微孔滤膜滤过后，按2.2.1项下的HPLC色谱条件，10μL样品进样，测定牦牛儿酮含量，并计算牦牛儿酮在莪术油中所占的百分比。

2.2.4 线性范围测定

分别精密吸取牦牛儿酮对照品储备液（508μg/mL）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，甲醇定溶至5mL。精密吸取上述各液10μL进样，结果见表2。以各样的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，并对各点进行回归，得回归方程为A=4480.8C+34673（r=0.9993）。结果表明：牦牛儿酮质量浓度在50.8～304.8μg/mL范围内呈良好线性关系。

2.3 正交试验设计及样品含量测定[6-9]

采用正交试验设计方法，药材粉碎过20目筛，以萃取温度、萃取压力、提取时间、夹带剂（95%乙醇）用量为实验因素[3]，取三水平，选用L9（34）正交表安排试验，因素水平表见表3。

按表3的实验条件提取莪术油，为减少误差，每个实验条件水平做3次，计算平均出油率；提取出的莪术油分别按“2.1、2.2”项下的相关规定进行测定，连续进样3次，取其各自的平均峰面积，代入线性回归方程，计算莪术醇、牦牛儿酮在莪术油中所占的百分含量。

3 结果与讨论

根据上述实验结果，以综合加权评分的方法对莪术油的出油率、莪术醇含量、牦牛儿酮含量3项指标进行综合评价，综合评分越高，说明该提取工艺越好，评分标准见公式1，评分结果见表4，方差分析见表5。

表5 方差数据分析

由表5可知，超临界萃取莪术挥发油的影响因素中，夹带剂浓度的影响较其他3项因素显著，萃取压力和萃取温度次之，萃取时间的影响较小。由此得出超临界萃取莪术挥发油的最佳工艺方案为A2B3C2D2，即萃取温度45℃，萃取压力25MPa，提取时间2h，夹带剂用量10%。

3.3 验证试验

取1kg粉碎的莪术药材按最佳工艺条件A2B3C2D2进行萃取实验，以莪术油提取率为指标进行考察，结果药材莪术油的提取率为3.8%。表明按最佳工艺提取，莪术油的提取量超过正交试验表中结果的较高值。说明工艺合理，可行性较高。

3.4 讨论

超临界CO2流体萃取莪术醇的最佳工艺为萃取温度45℃，萃取压力25MPa，提取时间2h，夹带剂（95%乙醇）用量10%，SFE法对莪术油及莪术醇的提取率远远高于文献报道的水蒸气蒸馏法的提取率。实验证明，超临界流体萃取技术较传统方法萃取能力强，萃取效率高，有利于提高产品收率和资源利用率。而且提取时间短、能耗低，还可避免使用大量机溶剂，减少污染，因此用超临界流体萃取技术提取莪术醇具有开发价值。

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