头孢曲松钠对谷氨酸作用后神经细胞的保护作用

刘春华, 王维治

头孢曲松钠在临床上一直作为一种有效的抗生素被广泛应用。但近期有研究表明,在戊四唑点燃的小鼠癫痫模型中[1],在应用戊四唑前 6d每天注射头孢曲松钠(200mg/kg),可以显著减轻戊四唑诱发的癫痫发作,减少死亡率。在转基因小鼠肌萎缩侧索硬化模型中[2],长期应用头孢曲松钠可以保留小鼠前爪握力,延缓小鼠病程和体重减轻等症状发生,生存期延长 10d,提示头孢曲松钠可能具有神经保护作用。故本试验着重研究头孢曲松钠对谷氨酸作用后神经细胞活性、谷氨酸摄取能力、以及细胞内钙超载反应的影响,以期发掘这种临床已长期安全应用其药物尚未人知的潜在作用。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 头孢曲松钠为上海新先锋药业有限公司生产,批准文号国药准字 H31020945,产品批号 051135;L-谷氨酸 (分子量为 147.13)为Sigma公司产品;DMEM高糖培养基为 Gibco公司产品;胎牛血清为杭州四季青公司产品;噻唑兰(thiazoylblue tetrazolium bromide,MTT)为 Sigma公司产品;L-[3H]-谷氨酸为英国 Amersham公司提供;Fluo-3/AM由日本同仁化学研究所提供;二氢红藻氨酸(dihydrokainic acid,DHK)由 Tocris公司提供;脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)酶联免疫试剂盒由 Promega公司提供;白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供;其余试剂均为市售分析纯。美国 Forma Scientific二氧化碳恒温培养箱;百万级无菌细胞培养间由哈医大附属二院实验中心提供;日本 Olympus IX70倒置显微镜;德国 ZEISS公司生产LSM-510-META型激光共聚焦扫描显微镜(laser scanning confocalmicroscope,LSCM)。

1.2 大鼠脑皮质神经细胞混合培养 根据Guillet B[3]等的方法并加以改良。无菌分离出生48h内 Wistar乳鼠大脑皮层,PBS液冲洗 2次;0.25%胰蛋白酶中剪碎后,37℃消化 3m in,中间轻轻振摇 2～3次。吸弃表面的胰蛋白酶,加入倍量含10%胎牛血清的 DMEM高糖培养液终止消化,1000rpm离心 3m in。吸弃上清液,加入培养液制成密度约 104的单细胞悬液,接种于涂有多聚赖氨酸的 96孔板中,置于 37℃、5%CO2培养箱中培养,48h全量换液,此后每周两次半量换液。倒置显微镜定期观察细胞形态变化,培养 8d待细胞成熟后用于模型制作。

1.3 实验分组 对照组：细胞正常培养 11d;头孢曲松钠组：细胞培养 8d时加入含头孢曲松钠培养液(终浓度 1mol/L)培养 2d,PBS冲洗后正常培养 24h。

1.4 MTT比色法检测有/无谷氨酸损伤时细胞活性 以 104密度在 96孔板培养细胞(每组 7孔),在培养 10d时应用或不应用谷氨酸损伤(终浓度为 50μmol/L含 L-谷氨酸培养液培养 15min,PBS冲洗后换正常培养液继续培养 24h)。每孔加入 5%MTT 20μl,37℃培养 6h后换 100μl二甲基亚砜溶解震荡 5min,酶标仪(波长 492nm)测各孔吸光度值,后者可反映细胞数量及活性。

1.5 L-[3H]-谷氨酸重摄取的测定 96孔板各组细胞(每组 5孔)每孔加入 L-[3H]-谷氨酸 317×107Bq/L,37℃孵育 10min,弃去液体,用 Hanks液洗涤 3遍,弃去洗涤液,每孔加入 0.5mol/L NaOH 1ml将细胞裂解,取 0.1ml消化液,加入 3ml闪烁液,放置6h后测定闪烁记数。摄取率换算成fmol/min。

1.6 LSCM测定细胞内 Ca2+浓度变化 避光条件下,96孔板各孔细胞(每组 5孔)PBS冲洗后,加入含有 Fluo-3/AM(终浓度 4mol/L)和 Pluronic-F127(终浓度 0.05%)的无血清的 DMEM培养液(每孔 100l),37℃孵育 4min。不含荧光探针 PBS液充分冲洗后加入含钙 PBS中(含 13mmol/L NaCl、2.68mmol/L KCl、8.09mmol/L Na2HPO4、1.46mmol/LKH2PO4及 0.9mmol/L CaCl2,pH值为7.4),室温稳定 20min。在 LSCM下向细胞加入 50mol/L谷氨酸作用 2min引起细胞短暂内钙超载中,在应用谷氨酸前 30s加或不加 DHK 100μmol/L。LSCM同一视野连续动态扫描,实时观测各组细胞荧光强度变化情况。488nm氩激光激发 Fluo-3/AM发出绿色荧光,当 Ca2+浓度在 10～1000nmol/L时荧光强度与Ca2+浓度的对数呈线数关系。荧光强度改变用不同颜色表示。

1.7 酶联免疫法检测培养上清液中脑源性神经营养因子(BDNF)、白细胞介素-6(IL-6)水平 收集细胞培养上清液,分别应用 BDNF、IL-6酶联免疫试剂盒,按试剂盒说明书操作,用酶标仪在 450nm处测定各孔吸光值,根据标准曲线得出相应 BDNF、IL-6含量。

2 结 果

2.1 大鼠脑皮层神经细胞形态学特征及改变接种细胞 24h后贴壁,少部分长出突起,胶质细胞开始铺展。3d时,神经元形态渐典型,突起间串联成简单环状网络,突起周围常见胶质细胞存在,逐渐形成胶质细胞层。6d时,神经胶质铺满整个底层,神经元位于其上,胞体饱满、边界清晰、折光性强。8d时,神经元突起明显,胞体大,呈锥形,形成明显神经网络。头孢曲松钠组神经细胞形态与对照组比较无差别。

2.2 MTT法测定有/无谷氨酸损伤时神经细胞活性 与对照组比较,无谷氨酸损伤时头孢曲松钠组吸光度值降低但无统计学意义;有谷氨酸损伤后其吸光度值明显升高(见表1)。

2.3 L-[3H]-谷氨酸重摄取的测定 头孢曲松钠组较对照组对谷氨酸的摄取率明显增加(见表1),提示头孢曲松钠可以提高神经细胞的谷氨酸摄取能力。

2.4 LSCM测定细胞内Ca2+浓度变化 静息状态下,对照组(141.3±6.2)与头孢曲松钠组(127.3±12.1)细胞内 Ca2+荧光强度的差别无统计学意义。加入谷氨酸短暂作用后,对照组由 141.3±6.2上升到 194.5±5.9,15min左右恢复至静息状态,头孢曲松钠组 Ca2+荧光强度由 127.3±12.1上升到170.9±3.4,10min内恢复至静息状态,故头孢曲松钠组较对照组 Ca2+荧光强度上升缓慢但恢复迅速;加入 GLT1拮抗剂 DHK后,两组 Ca2+荧光强度变化基本相同,即明显大幅度上升后无明显下降。

2.5 上清液中 BDNF、IL-6水平 头孢曲松钠组较对照组细胞培养上清液中 BDNF含量明显增加,而两组 IL-6含量的差别无统计学意义(见表1)。

表1 各组有/无谷氨酸损伤时细胞活力、谷氨酸摄取率以及上清液中 BDNF、IL-6含量比较(±s)(n=7)

表1 各组有/无谷氨酸损伤时细胞活力、谷氨酸摄取率以及上清液中 BDNF、IL-6含量比较(±s)(n=7)

与对照组比较*P＜0.01,△P＞0.05

对照组头孢曲松钠组0.813±0.023 0.795±0.010△0.624±0.028 0.738±0.021*213.1±6.5 277.1±10.7*153.1±3.5 237.1±4.7*25.3±1.2 27.3±2.1△

3 讨 论

谷氨酸是中枢神经系统中最主要的兴奋性神经递质之一,但其在细胞外浓度过高就会产生兴奋性神经毒性,导致钙离子通道的开放、神经元肿胀变性等一系列有害的生化过程,参与了诸多神经系统疾病的致病过程。因此谷氨酸的摄取和清除对于维持正常生理状态以及阻断诸多神经系统疾病的发生发展都具有重要意义。本实验研究表明,经头孢曲松钠预处理的神经细胞,在遭受谷氨酸损伤时细胞存活数量和活性提高,在加入谷氨酸后其重摄取谷氨酸能力增强,提示头孢曲松钠有助于降低细胞外谷氨酸浓度,从而减轻谷氨酸兴奋性神经毒性的损害,对神经细胞产生保护作用。

神经细胞内钙离子稳态的破坏以及细胞内钙离子超载是谷氨酸兴奋性神经毒性损害过程中的一个重要环节,故本实验进一步研究头孢曲松钠对细胞内钙离子浓度的影响。实验结果表明,静息状态下头孢曲松钠预处理对细胞内钙离子浓度无影响,但加入谷氨酸短暂作用诱导神经细胞内钙超载状态下,头孢曲松钠能有效地拮抗谷氨酸对细胞内钙的影响,对神经细胞产生保护作用。

关于头孢曲松钠减轻谷氨酸神经损伤的具体机制目前不清。最新研究发现,头孢曲松钠能上调谷氨酸转运体中谷氨酸转运体 1(GLT-1)的表达。在亨廷顿的 R6/2小鼠模型中[4],腹腔注射头孢曲松钠(200mg/kg)5d后,免疫斑点检测可见脑皮层和纹状体中 GLT-1蛋白表达明显增加,且模型中存在的纹状体谷氨酸摄取缺陷被纠正。谷氨酸转运体在终止谷氨酸能突触传递中起重要作用,由于谷氨酸没有酶解灭活机制,只能通过谷氨酸转运体重摄取后参与谷氨酸-谷氨酰胺循环,从而消除其与相应谷氨酸受体的结合。GLT-1可能是目前人类已知的最重要谷氨酸转运体[5],其在前脑向胞内转运的谷氨酸占全部谷氨酸摄取的 90%。所以,可以推测头孢曲松钠可能是由于促进了 GLT-1的表达,使胞外多余谷氨酸更多地被转运清除,从而降低了胞外谷氨酸浓度以及继发的细胞内钙超载作用。本研究进一步应用 LSCM观察到,正常情况下头孢曲松钠能有效拮抗谷氨酸引起的短暂内钙超载作用,而事先加入GLT1高度特异敏感性抑制剂 DHK后,头孢曲松钠组与正常组细胞内 Ca2+荧光强度变化曲线大致相同,头孢曲松钠的上述拮抗作用消失。这进一步证实了前述的推断,即头孢曲松钠对神经细胞谷氨酸重摄取增强效应是通过调节 GLT1来实现的。

本研究同时发现,除了具有减轻谷氨酸损伤作用之外,头孢曲松钠还能增加神经营养因子 BDNF的含量,故其神经保护作用机制还可能为通过 BDNF的抗细胞凋亡作用来增加神经细胞的存活数量。头孢曲松钠不能引起炎症因子 IL-6的浓度变化,提示头孢曲松钠的神经保护作用中可能不包括抗炎、抗菌机制。

综上所述,头孢曲松钠可能通过多种机制来发挥神经保护作用,深入发掘头孢曲松钠的这种潜在治疗作用,在理论和实际应用方面都具有重要意义。

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[2]Robert H,Brown JD,Phil MD.Amyotrophic Lateral Sclerosis-A New Role for Old Drugs[J].N Engl JMed,2005,31：1376-1378.

[3]Guillet B,Masmejean SLF,Samuel D,etal.Developmental expression and activity of high affinity glutamate transporters in rat cortical primary cultures[J].Neurochem Int,2002,40：661-671.

[4]Sari Y,Prieto AL,Barton SJ,etal.Ceftriaxone-induced up-regulation of corticaland striatalGLT1 in the R 6/2model of Huntington's disease[J].Biomed Sci,2010,153(1)：329-337.

[5]Shigeri Y,Seal RP,Shimamoto K.Molecular pharmacology of glutamate transporters,EAATs and VGLUTs[J].Brain Res Rev,2004,45(3)：250-265.