禽流感实用诊断技术

谢青梅,毕英佐(华南农业大学动物科学学院,广东广州 510642）

禽流感实用诊断技术

谢青梅,毕英佐(华南农业大学动物科学学院,广东广州 510642）

禽流感(AI）是由A型流感病毒(AIV）引起的一种禽类病毒性烈性传染病,OIE把该病定为A类烈性传染病。许多家禽和野鸟对A型禽流感病毒都有易感性，发病和危害最大的主要是鸡、火鸡。鸭、鹅感染H5亚型流感病毒死亡率很高，经济损失很大。鸡感染禽流感后可表现出严重的呼吸系统疾病，出现产蛋量下降、致死率很高的急性出血性临床症状；也可表现为轻微的呼吸道感染、轻微产蛋率下降，或者是无症状隐性带毒等亚临床症状；致病力尚弱的毒株逐渐变异为高致病性的毒株，危害鸡群的健康。所以快速有效的诊断禽流感病毒是及时发现和及早控制禽流感疫情的关键。

一、临床诊断

（一）基本观点 禽流感的流行在一定时间内已平息下来，但任何免疫失败均将导致该病的散发或呈地方性流行。疫苗毒株和流行野毒株之间有一定差异，需要警惕“非典型”H5N1亚型禽流感病毒的存在与发生。

高致病性禽流感由H5、H7亚型禽流感病毒引起。患禽主要表现为：体温升高，精神萎顿，毛松，打堆，食欲废绝，下痢。鸡冠发绀呈暗红色或苍白，头部、面部浮肿，脚鳞出现紫色出血斑。部分病鸡出现头颈和腿部麻痹、抽搐等神经症状。病程1～2 d，死亡率可达100%。有时没有明显症状即可见到鸡只死亡。种鸡仅见产蛋下降、畸形蛋多，多由“点”暴发转变为全群暴发。鸭、鹅等水禽可见神经和腹泻症状，可见眼角膜炎、甚至失明等症状。剖检可见肠道、盲肠扁桃体、胰腺轻微出血，甚至出现喉头气管有粘液的“非典型”病变，种鸡卵泡变性与坏死、输卵管炎等。

（二）指示性临床诊断指标

1.未免疫禽群。突发、急剧的倍数增长的死亡；萎顿、鸡冠发绀的鸡只很快死亡；早期病死鸡以全身性出血性变化为主。未免疫鸡群出现HI抗体阳性就可确诊。

2.免疫禽群。鸡群中出现萎顿，鸡冠发绀，趾部角质变红趋向的鸡只很快死亡，并延续数天，可见肿头及流泪。病死鸡肝脏变化为主，呈现偏淡的多色彩、质脆，胰腺、腺胃乳头出血常见。检查HI抗体可见群体抗体水平参差不齐，出现一定数量HI抗体滴度≥12log2的样本。

3.未免疫鸭。沉郁、明显的神经症状，头颈扭曲、抽搐、瘫痪，临床症状出现后死亡急速上升，死亡率30%～100%。种鸭初期采食下降，产蛋下降可达10%～90%。

4.免疫鸭。商品鸭发病日期在20日龄以后，神经症状和死亡明显。种鸭产蛋下降30%～60%，很少死亡。

二、鉴别诊断

H9亚型禽流感非常温和，经常与其他疾病一起并发感染，症状和病变均不明显。H5亚型禽流感和典型鸡新城疫症状很相似，可根据以下要点进行鉴别诊断（见表1）。

三、禽流感病毒鉴别诊断技术

目前，禽流感的鉴别诊断技术很多，常用技术主要有病毒分离鉴定、病毒血清中和试验和RT-PCR技术、荧光定量PCR技术、RTLAMP技术等分子生物学技术。病毒分离鉴定是传统可靠的方法，但必须在国家许可的P3实验室进行。在众多的分子生物学技术中最常用的技术还是RT-PCR技术，不需要分离病毒，具有快速、简便的优点；RT-LAMP技术是一新型的分子生物学技术，不需要分离病毒，不需要昂贵的PCR仪和电泳系统，加入染料后检测结果肉眼可视，适合于基层简易实验室使用；荧光定量PCR技术也是非常准确的分子生物学技术，但他需要昂贵的荧光定量PCR仪器和特殊的试剂等，在口岸的检验检疫中多用。下面详细介绍几种常用禽流感病毒的检测技术。

（一）病毒分离和鉴定采取发病鸡喉拭子、肛拭子或组织器官，加入适量灭菌生理盐水匀浆，制成10%的悬液，加入双抗（最终浓度为青霉素1 000 IU/ml、链霉素1 000 IU/ml），于 37℃孵育 30 min，然后3 000 r/min离心10～15 min，取上清，再用0.45μm的滤膜过滤除菌，滤液备用。

将处理后的样品滤液接种于9～11日龄非免疫鸡胚，0.2 m1/胚，37℃孵化，每日照蛋2次，弃去18 h内死胚，24～48 h死亡鸡胚置4℃冷却4 h或过夜。无菌收获尿囊液，测定尿囊液对1%鸡红细胞的血凝活性并观察鸡胚病变。有血凝活性者作进一步鉴定；无血凝活性者将其尿囊液和羊水盲传两代，仍无血凝活性者弃去。取无菌澄清的尿囊液用于病毒血清型鉴定。采用血凝抑制(HI）试验方法用H5、H9亚型禽流感和新城疫(ND）标准阳性血清进行测定。

（二）RT-PCR鉴别诊断技术RT-PCR方法是鉴别诊断禽流感病毒的非常简便、快速的方法。分别用H5亚型禽流感病毒（H5 AIV）、H9亚型禽流感病毒（H9 AIV）和新城疫病毒（NDV）特异性引物进行RT-PCR鉴别诊断，根据PCR扩增产物电泳条带大小判定结果。在鉴别诊断疑似病例时，此RT-PCR方法显示了较大的优越性，在临床诊断上快速鉴别诊断H5、H9亚型AIV和NDV的感染具有重要的实践意义。

具体操作如下：取病料或喉拭子，加入适量灭菌生理盐水匀浆，离心取上清，用RNAout试剂盒（按说明书进行）提取总RNA。然后用H5 AIV、H9 AIV和ND对应的引物用RT-PCR一步法试剂盒进行扩增，PCR产物用1%的凝胶电泳进行检测。若电泳条带大小为545 bp，就可以初步判定结果为H5亚型AIV；若电泳条带大小为488 bp，就可以初步判定结果为H9亚型AIV；若电泳条带大小为672 bp，就可以初步判定结果为NDV。为了进一步确诊，需要送PCR扩增产物到生物工程公司进行序列测定，根据序列分析确诊结果。鉴别诊断的经典引物序列如下：

1.H5 AIV上游引物（H5UP）：5,-ACACATGCYCARGACATA CT-3’，下游引物（H5DN）：5,-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3,，扩增产物大小为545bp。

表1 H5亚型禽流感和典型鸡新城疫的鉴别诊断

2.H9 AIV上游引物（H9UP）：5,-CTYCACACAGARCACAAT GG-3,，下游引物（H9DN）：5,-G TCACACTTGTTGTTGTRTC-3,，扩增产物大小为488bp。

3.DNV上 游 引 物（NDUP）：5,-TCATACCCAGATTATATCG-3,；下游引物（NDDN）：5,-TGGT AATCTTGTTCATC-3,，扩增产物大小为672bp。

（三）实时荧光定量RT-PCR技术荧光RT-PCR技术是20世纪90年代末发展起来的新技术,将荧光素标记的探针与引物一起,在荧光PCR仪中反应,电脑对整个反应进行实时监测,避免了交叉污染,提高了检测敏感性,已成功用于人乙型肝炎病毒、衣原体、艾滋病病毒等的检测,荧光RT-PCR方法对PCR产物可以实时监控,省却了电泳和EB染色；由于采用特异性荧光探针和高灵敏度荧光PCR仪,比传统的PCR方法灵敏度高100～1 000倍。在检验检疫实践工作中常用。深圳出入境检验检疫局与深圳太太基因工程有限公司联合研制了同时检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的实时荧光多重RT-PCR检测试剂盒，广泛用于口岸的检验检疫中。

（四）RT-LAMP诊断技术环介导等温扩增技术(LAMP）是一种新颖的恒温核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的6个区域,设计4种特异引物（2条外引物和2条内引物），利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase）在恒温(65℃左右）中反应1 h，即可完成核酸扩增反应，反应结果可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断；也可以在终产物中加入SYBR GreenⅠ染料，直接用肉眼观察结果,而不需模板热变性、长时间的温度循环、凝胶电泳、紫外观察等过程。国外有报道用RT-LAMP技术检测人流感H1、H2和H3亚型流感病毒,还用于鉴定流感A、B型的诊断。H5亚型禽流感病毒RT-LAMP技术是一种检测H5亚型禽流感病毒的有效快速的可靠方法,对生产实践具有实践指导意义。

H5亚型禽流感病毒的RTLAMP方法具体操作为：从组织匀浆或尿囊液中提取AIV总RNA 作 为 模 板。 在 25 μl反 应体系中分别加入以下组分:10×buffer 2.5 μl,dNTPs(2.5 mmol/L）4 μl,FIP/BIP(10 μmol/L）2 μl,引 物 F3/B3(10μmol/L）0.5 μl,Bst DNA polymer-ase 1μl(8U/μl）,AMV反 转 录 酶1μL(100U/μl）,RNA 5 μl,DEPC 水 6.5 μl。混匀后,42℃保温10 min，之后在65℃扩增60 min,最后80℃反应10 min终止反应,扩增产物可以用0.02 g/L琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L的溴化乙锭）电泳检测,电泳条件为80 V、30 min，用VL凝胶成像系统观察并记录结果；或者在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ染料，阳性结果会呈现绿色，不需用琼脂糖凝胶电泳检测。经典的检测H5亚型禽流感病毒的LAMP引物如下：

外引物F3: 5,-GCCATTCCA CAACATACACCC-3,；

内引物FIP:5,-CTGAGTCCA GTCGCAAGGACTAATCTGTTTT-TCTCACCATCGGGGGAA TGCC-3,;

内引物BIP: 5,-GGATGGCA GGGAATGGTAGAT-GG-TTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATTG C-3,；

外引物B3: 5,-TGGTGACTC CATCTATTGCCT-3,。

(五）其他技术禽流感病毒检测技术还有胶体金试纸条技术、蛋白芯片技术、基因芯片技术、TEMPCR技术等检测技术，这些技术目前看来还是不太适合于普通实验室使用。禽流感监测和诊断技术的研究在不断的深入和拓宽，这对防控禽流感有非常重要的意义。