蟾乌巴布膏的质量标准研究

周庆氢， 张 聪， 谢 松

(1.上海雷允上药业有限公司，200002;2.上海市中药研究所，201401)

蟾乌巴布膏是刘嘉湘教授的临床验方，由蟾蜍、川乌、重楼等24味名贵药材组成，应用现代制剂技术，采用亲水性高分子辅料制备的巴布膏。蟾乌巴布膏对肿瘤以及其他疼痛均有良好的疗效，更有活血化瘀，消肿止痛之功效，被临床广泛认可，是国内唯一肿瘤中药外用药。为控制该制剂质量，采用色谱法对其中的蟾酥、生川乌、生关白附、两面针、荜茇、细辛、乳香、没药、丁香、肉桂等药材进行了鉴别，并采用气相谱法对蟾乌巴布膏中樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯等多个有效成分的含量进行了测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 HP-6890 plus气相色谱仪(美国HP公司)，氢火焰检测器，HS3120型超声波提取仪(淮阴汉邦科技有限公司)，梅特勒托利多AE240电子天平(十万分之一)。

1.2 试药 丁香酚、桂皮醛、胡椒碱、樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯对照品，两面针、荜茇、细辛、乳香、没药对照药材均购自中国药品生物制品检定所，石油醚(60～90℃)为分析纯(杭州炼油厂)，其余试剂均为分析纯(中国医药集团上海化学试剂公司)，硅胶G、硅胶H、硅胶GF254薄层预制板(青岛海洋化工厂)。

1.3 样品 蟾乌巴布膏(上海雷允上药业有限公司)，批号:071001，071101，071201。

2 方法与结果

2.1 色谱鉴别

2.1.1 蟾酥的薄层鉴别［1］取蟾乌巴布膏1片，剪成小块，除去盖衬，置150 mL回流瓶中，加氯仿50 mL，加热回流1 h，取上清液蒸干，残渣加氯仿1 mL使溶解，作为供试品溶液。

另取脂蟾毒配基及华蟾酥毒基对照品，加氯仿制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验［2］，吸取供试品溶液及对照品溶液各5 μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-丙酮(4∶3∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点(见图1)。

图1 蟾酥薄层鉴别色谱图

2.1.2 生川乌、生关白附的薄层鉴别［3］取蟾乌巴布膏1片，剪成小块，除去盖衬，置150 mL回流瓶中，加浓氨试液0.5 mL，氯仿50 mL，加热回流1 h，取上清液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

取生川乌、生关白附对照药材1 g，加浓氨试液0.5 mL，氯仿 50 mL，加热回流 1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。

另取乌头碱对照品，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液15μL，及对照药材、对照品溶液各10μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二乙胺(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.1.3 两面针的薄层鉴别［4］取蟾乌巴布膏1片，剪成小块，除去盖衬，置150 mL回流瓶中，加浓氨试液0.5 mL，氯仿50 mL，加热回流1 h，取上清液蒸干，残渣加氯仿1 mL使溶解，作为供试品溶液。

另取两面针对照药材1 g，加浓氨试液0.5 mL，氯仿30 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿1 mL使溶解，作为对照药材溶液。

照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液5μL，对照药材溶液3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液(20∶5∶3∶1∶0.12)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

2.1.4 荜茇的薄层鉴别［5］取蟾乌巴布膏1片，剪成小块，除去盖衬，置150 mL回流瓶中，加浓氨试液0.5 mL，氯仿50 mL，加热回流1 h，取上清液蒸干，残渣加氯仿1 mL使溶解，作为供试品溶液。

取荜茇对照药材0.5 g，加浓氨试液0.5 mL，氯仿30 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿1 mL使溶解，作为对照药材溶液。再取胡椒碱对照品，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法(中国药典2005年版一部 附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μL，对照药材1μL和对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-丙酮(7∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇(v/v)溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点(见图2)。

图2 荜茇的薄层鉴别色谱图

2.1.5 细辛的薄层鉴别［6］取本品1片，剪成小块，除去盖衬，置150 mL回流瓶中，加乙酸乙酯50 mL，加热回流1 h，取上清液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。

另取细辛对照药材1 g，加乙酸乙酯30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为对照药材溶液。

照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μL和对照药材溶液3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(85∶15)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(见图3)

图3 细辛的薄层鉴别色谱图

2.1.6 乳香、没药的薄层鉴别［7］取本品1片，剪成小块，除去盖衬，置150 mL回流瓶中，加乙酸乙酯50 mL，加热回流1 h，取上清液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。

取乳香、没药对照药材各0.5 g，各加乙酸乙酯30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣分别加乙酸乙酯2 mL使溶解，作为对照药材溶液。

照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，取供试液溶液10μL，对照药材溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(85∶15)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(见图4)

图4 乳香、没药的薄层鉴别色谱图

2.1.7 丁香、肉桂的鉴别 取本品2片，剪成小块，除去盖衬，置250 mL回流瓶中，加乙酸乙酯100 mL，水浴上回流1 h，迅速冷却，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液减压回收至干，残渣用乙酸乙酯溶解并转移至2 mL量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度，离心，取上清液，作为供试品溶液。

另取丁香酚和桂皮醛对照品，分别加乙酸乙酯制成每1 mL含丁香酚0.15 mg、桂皮醛0.015 mg的溶液，作为对照品溶液。照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)试验，用弹性石英毛细管柱，以聚乙二醇PEG-20M为固定相，柱温为180℃。分别吸取供试品溶液和对照品溶液各1μL，注入气相色谱仪。供试品溶液色谱图中应呈现与对照品保留时间相同的色谱峰。

2.2 樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯含量测定［8］

2.2.1 试液的配制 内标溶液的制备:取萘适量，精密称定，加无水乙醇溶解，制成每1 mL含1.2 mg的溶液，即得。

混合标准品的制备:取樟脑、薄荷脑、冰片和水杨酸甲酯对照品适量，分别精密称定，分别加无水乙醇制成每1 mL含1、2、1、1 mg的溶液。分别精密量取上述4种对照品溶液1 mL，置同一20 mL量瓶中，精密加入上述内标溶液1 mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备:取蟾乌巴布膏5片，每片分别精密截取6 cm2，共30 cm2，剪成小块，除去盖衬，置150 mL回流瓶中，精密加入无水乙醇50 mL，称定重量，置水浴上回流2 h，迅速用冰浴冷却，用无水乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10 mL，置20 mL量瓶中，精密加入内标溶液1 mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 色谱条件及系统适应性试验 J＆W INNOWAY弹性石英毛细管柱(固定相为聚乙二醇PEG-20 m，30 m ×0.53 mm，固定相厚度 1 μm)，程序升温，柱温140℃保持23 min，以每分钟6℃升温至200℃保持20 min，进样温度280℃;检测器温度300℃，分流进样，分流比1∶1，理论板数以薄荷脑计算不低于20 000。

分别取樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯空白样品进行平行试验，空白样品均无干扰，且供试品在内标物保留时间处无干扰。见图5～7。

图5 供试品中樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯含量测定气相色谱图

图6 基质空白溶液气相色谱图

图7 樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯对照品溶液气相色谱图

2.2.3 线性关系试验 精密吸取混合对照品贮备液按一定稀释比例，配制成不同浓度的混合对照品溶液，分别吸取1μL注入气相色谱仪，测得各组份及内标物的峰面积，并计算回归方程，结果见表1。

表1 樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯等线性关系考察

表明:在线性范围内樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯线性关系良好。

2.2.4 日间精密度 取线性关系试验中取同一供试品溶液在不同日分别进样5次，每次1μL，在以下时间点:0、1、2、3、5 d 时测定色谱峰吸收值，结果樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯的 RSD分别为0.88% 、1.65% 、1.42% 、1.11% 。

2.2.5 日内精密度 取线性关系试验中同一供试品溶液在当日分别进样5次，每次1μL，在以下时间点:0、1、2、4、10 h 时测定色谱峰吸收值，结果樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯的 RSD分别为0.32% 、1.00% 、0.29% 、1.49% 。

2.2.6 重复性试验 取蟾乌巴布膏(批号:071001)，分取5份，分别按2.2.1项及2.2.2项下的方法制备供试品溶液，进样测定，结果见表2。

表2 日重复性试验(n=5)

2.2.7 回收率试验 取蟾乌巴布膏(批号:071101)，分取6份，加入一定量对照品，按2.2.1项及2.2.2项下的方法制备供试品溶液，进样测定，结果见表3。

表3 回收率实验结果(n=6)

2.2.8 样品测定 分别精密吸取3批样品(071001、071101、071201)的供试品溶液，与混合对照品溶液1μL注入气相色谱仪，进样测定含量，结果见表4。

3 讨论

3.1 蟾乌巴布膏是采用亲水性高分子辅料制备的巴布膏，为保证产品质量我们对该产品中的多味药材进行了定性的研究，采用薄层色谱法对其中的蟾酥、生川乌、生关白附、两面针、荜茇、细辛、乳香、没药、丁香、肉桂等药材进行了鉴别，建立蟾乌巴布膏中蟾酥、两面针、荜茇、细辛、乳香、没药、丁香、肉桂的定性方法，其中生川乌和生关白附的鉴别，因为存在干扰，故需要进一步研究。

表4 样品的含量测定

3.2 本试验比较了以不同溶剂(甲醇、无水乙醇)、不同提取方法(超声、回流、索氏提取)和不同超声时间(15、30、45、60 min)对樟脑、薄荷脑、冰片和水杨酸甲酯提取效果的影响。结果以无水乙醇回流提取的效率最高，回流时间2 h，已可将樟脑、薄荷脑、冰片和水杨酸甲酯提取完全，故选用无水乙醇回流提取2 h作为提取条件。

3.3 通过实验，制定了蟾乌巴布膏中蟾酥、两面针、荜茇、细辛、乳香、没药、丁香、肉桂等八味药材的色谱鉴别方法，并用气相色谱法测定了产品中樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯的含量。方法简便、专属性强、重现性好，可有效的控制蟾乌巴布膏的质量。

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