正交法优选麸炒枳实最佳炮制工艺

于晓黎， 林桂梅， 谢 君， 张 怀， 贾天柱，2*

(1.辽宁中医药大学，辽宁大连116600;2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁大连116600)

枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis osbeck的干燥幼果［1］。始载于《神农本草经》，列为中品，具有破气消积，化痰散痞之功。在分析枳实有效成分中发现橙皮苷、柚皮苷等黄酮苷类化合物为枳实抑制平滑肌收缩的主要有效成分，辛弗林等生物碱类化合物为其升压、抗休克的主要有效成分［2］。上述成分含量的差异影响到药材的品质。枳实历代有多种炮制方法，然而仅麸炒收载在《中国药典》2005版中，但其炮制工艺尚不够规范，质量亦难以控制。因此，本试验以辛弗林及总黄酮含量为考察指标，采用正交设计法，优选麸炒枳实的最佳工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器 日本岛津LC-20AT液相色谱仪(SPDM20A检测器，LC-20AB泵，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样器，CBM-20A数据转换模器);岛津LC-Solution色谱数据工作站;日立U-3010紫外分光光度计;METTLER AE240型十万分之一分析天平(瑞士METTLER)，FA1004B电子天平(上海精密科学仪器有限公司)

1.2 试药 生品枳实药材经本校中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为芸香科酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果;辛弗林对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号110727-200306);橙皮苷对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号110722-200613);甲醇为色谱纯，水为纯净水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC法测定辛弗林含量

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18(5μm，200 mm×4.6 mm);流动相:甲醇-磷酸水溶液(含0.18%磷酸0.22%十二烷基硫酸钠)(58:42);柱温:40℃;流速:1 mL/min;检测波长:275 nm;进样量:10μL。色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取辛弗林对照品适量，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1 mL含0.702 mg的对照品贮备液，精密吸取5 mL对照品贮备液，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得0.070 2 mg/mL的辛弗林对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取麸炒枳实样品适量，粉碎为中粉，取约1 g，精密称定，按中国药典2005年版一部枳实项下供试品溶液制备要求操作，过0.45 μm 滤膜，备用［1］。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取浓度为0.070 2 mg/mL 的辛弗林对照品溶液 1、5、10、15、20 μL，按2.1.1项下操作，以对照品的量对峰面积进行回归分析，得回归方程为 Y=31 623X－977.11，r=0.999 9，辛弗林在0.070 2～1.404μg的范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取辛弗林对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，以峰面积计算RSD值为1.5%。

2.1.6 重复性试验 取同批样品6份，分别按样品含量测定方法进行测定，结果RSD为1.6%。

图1 麸炒枳实HPLC色谱图

2.1.7 稳定性试验 取供试品溶液，按样品含量测定方法于 0、2、4、6、8、10、12、24 h 进行测定，结果辛弗林峰面积的RSD为1.9%，结果表明供试液在24 h内稳定。

2.1.8 加样回收率试验 精密量取已知辛弗林含量的枳实样品6份，分别精密加入辛弗林对照品适量，按供试品的制备方法制备各供试液，依法测定各样品中辛弗林的含量，结果平均回收率为99.2%，RSD为2.7%。

2.2 分光光度法测定总黄酮含量

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品1.72 mg置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得0.034 4 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取麸炒枳实样品适量，粉碎为中粉，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1.5 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，蒸干，残渣加水10 mL使溶解，摇匀，通过聚酰胺柱(60～90目，2.5 g，内径1.5 cm，干法装柱)，用水50 mL洗脱，弃去水液，再用甲醇100 mL洗脱，收集洗脱液，转移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，稀释25倍，备用。

2.2.3 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，照分光光度法(中国药典2005年版一部附录Ⅴ)，以试剂空白作参比，在283 nm处测定吸收度，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归分析，方程为Y=36.555X+0.122 9，r=0.999 0。表明橙皮苷浓度在0.006 88～0.034 4 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验 取橙皮苷对照品溶液6份，按拟定方法测定吸收度，结果6次吸收度相对标准偏差为1.7%，表明精密度良好。

2.2.5 稳定性试验 取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h测定其吸收度RSD 为1.1%，结果表明供试品溶液于室温下在24 h内稳定性良好。

2.2.6 重复性试验 取同批样品6份，按拟定方法测定含量，其浓度分别为 7.62、7.84、7.98、7.78、7.96、8.01 mg/mL，RSD为1.9%，表明重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验 精密量取已知总黄酮含量的枳实样品6份，分别精密加入橙皮苷对照品适量，按拟定方法测定，结果平均回收率为98.3%，RSD为2.1%，符合有关规定。

2.3 正交试验及结果

2.3.1 正交试验因素水平设计 以温度(A)，时间(B)，加麸量(C)为考察因素，每个因素取3个水平以辛弗林含量，总黄酮含量为指标采用正交试验对枳实的麸炒工艺进行优选。因素水平见表1。

表1 因素水平表

2.3.2 试验方法 将生药切片置于煤气炉上，将铁锅加热至所需温度，均匀撒入定量麦麸，即刻烟起，随之投入净枳实片，快速翻动，炒至枳实表面淡黄，麦麸色黑，取出，筛去麦麸，放凉［3］。

本试验采用综合评分法，将数次试验中辛弗林含量最高的试验数据定为100，其他各次与其相比记分;同法进行总黄酮评分。将两个指标等比例加权计入综合评分。由综合评分确定所选指标的优劣。

2.3.3 数据处理及分析 有关试验数据及其计算分析结果见表2、表3。

3.2 最佳工艺验证试验 称取3份枳实样品，以最佳工艺方法炒制，测定其辛弗林及总黄酮含量。结果见表4。

表2 麸炒枳实炮制正交试验因素水平分析

表3 方差分析表

表4 验证试验

4 讨论

4.1 从表2可知，对辛弗林及总黄酮含量影响因素大小依次为A>C>B，从表3方差分析结果表明，A具有显著性影响，B，C无显著性影响。结合各因素的K值(越大越好)可得出最佳组合是A2B3C1。通过对最佳工艺的验证实验证明了本工艺可行，即生品枳实投麸量100:5，于180℃，炒制1 min。

4.2 黄酮类化合物分子中具有无取代邻二酚羟基时可与Al3+形成配合物，这些配合物可产生荧光或颜色加深，这些性质可用于黄酮类成分的定性、定量分析［4］。由于枳实内所含二氢黄酮类不具有邻位无取代邻二酚羟基，加入硝酸铝试剂后不产生此类效应，无法以显色法进行含量测定。考虑到枳实内所含黄酮类成分远大于其他类成分的含量，试验采用聚酰胺对黄酮类成分进行纯化。经聚酰胺处理后除杂效果明显，纯化后的总黄酮样品液可直接进行含量测定。

［1］中国药典［S］.一部.2005:172.

［2］朱祥枝，潘东明.四种枳实中药材柚皮甙、橙皮甙和辛弗林含量的比较分析［J］.福建师范大学学报(自然科学版)，2005，21(1):91-93.

［3］贾天柱.中药炮制学［M］.上海:上海科学技术出版社，2008:128-129.

［4］梁生旺.中药制剂分析［M］.北京:中国中医药出版社，2005:127-129.