维药瘤果黑种草子质量标准研究
2010-09-17王园姬骆从艳慕春海李超鹏
王园姬, 陈 文, 骆从艳, 慕春海, 李超鹏
(新疆石河子大学药学院教育部重点实验室,新疆石河子832000)
黑种草为毛茛科植物瘤果黑种草(Nigella glandulifera Freyn)的干燥成熟种子。秋季采收成熟果实,除去泥沙及果皮,晒干[1]。目前作为药用的有3个种,分别为瘤果黑种草(Nigella glandulifera Freyn),又名腺毛黑种草;果黑种草(Nigella sativa Linn),又名家黑种草;以及黑种草(Nigella damascene L.)[2]。
瘤果黑种草子为新疆维吾尔族和西双版纳傣族习用药材,别名斯亚旦。其功效为利尿、活血、解毒、通乳;还可乌发、延缓衰老[3]。化学成分主要有黄酮、皂苷、脂肪酸、挥发油和生物碱等[4]。国外有文献报道其生物活性主要为抗氧化、降血糖[5]、抗肿瘤等[6]。已有研究证实瘤果黑种草子中含有多种常春藤皂苷类化合物[7,8],并有对其中总黄酮测定的研究[9],但尚未见有关于常春藤皂苷元含量测定的报道。原药材的质量标准也仅有性状鉴别。本实验建立了其薄层鉴别的方法,并进一步建立了HPLC测定瘤果黑种草子中常春藤皂苷元含量。实验结果表明该方法准确、快速、专属性强,为瘤果黑种草子药材质量标准的修订提供了实验依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters 600型高效液相色谱仪,Waters2996检测器;UV-2401型紫外可见光分光光度计(日本岛津);Sartorius(BP211D)电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);超声波提取器。
1.2 试药 瘤果黑种草子对照药材(中国药品生物制品检定所,批号121428-200501);常春藤皂苷元对照品(中国药品生物制品检定所,批号820-20002);硅胶G(青岛海洋化工有限公司)。水为自制超纯水;乙腈为色谱纯试剂,其他溶剂为分析纯试剂。瘤果黑种草子(购自新疆乌鲁木齐市二道桥药材市场),由新疆石河子大学药学院成玉怀副教授鉴定为瘤果黑种草子(Nigella glandulifera Freyn)。
2 方法与结果
2.1 薄层色谱鉴别 称取常春藤皂苷元对照品适量,用甲醇溶解配制成0.16 mg/mL的溶液,作为对照品溶液。称取瘤果黑种草子药材粉末(过30目筛)与对照药材各约0.5 g,分别加70%乙醇加热回流提取1 h,常压过滤。滤液分别作为供试品溶液和对照药材溶液。照薄层色谱法试验,用毛细管分别吸取供试品溶液、对照药材溶液及常春藤皂苷元对照品溶液适量,点于同一硅胶G薄层板上,以苯-甲醇-甲酸(17∶6∶1)为展开剂,展开、取出、晾干,喷以10%的硫酸-乙醇试液,105℃烘至斑点清晰。供试品色谱中,在与对照药材及常春藤皂苷元对照品色谱相应的位置上,显示清晰可见的紫色斑点。见图1。
2.2 HPLC测定
2.2.1 色谱条件与系统适用 色谱柱:Kromasil100-5C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相:乙腈-0.05%磷酸水(68∶32);检测波长:208 nm;柱温:20℃;流速:1.0 mL/min;进样体积:20μL。理论板数按常春藤皂苷元峰计不低于4 000。对照品及样品色谱图见图2。
图1 瘤果黑种草子TLC薄层图
图2 常春藤皂苷元(A)对照品和瘤果黑种草子药材(B)HPLC图谱
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取减压干燥至恒重的常春藤皂苷元对照品适量,加甲醇制成0.21 mg/mL的溶液,即得。吸取此对照品溶液1 m L到10 mL量瓶中,甲醇稀释至刻度,得浓度为0.021 mg/mL的对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 称取本品粗粉(过30目筛)约2.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加甲醇50 mL,超声提取30 min,滤过,残渣再加甲醇50 mL,超声提取30 min,甲醇适量清洗残渣,合并滤液与洗液,减压挥干溶剂。残渣加10 mL水溶解,水饱和正丁醇萃取3次,每次20 mL,合并萃取液,减压挥干溶剂。残渣加甲醇20 mL,盐酸4 mL,70℃加热水解4 h。水解产物加水10 m L,氯仿萃取2次,每次20 mL,合并萃取液,减压挥干溶剂。残渣用甲醇溶解并转移至50 m L量瓶中,甲醇稀释至刻度,摇匀,过0.22μm的微孔滤膜,取续滤液,即得。
2.2.4 线性关系考察 按上述色谱条件,精密吸取0.021 mg/mL对照品溶液3 mL于5 mL量瓶中,得浓度为12.6 μg/mL对照品溶液。分别精密吸取12.6μg/m L的对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL 到5 mL 量瓶中,甲醇稀释至刻度(浓度分别为 0.252、0.504、1.26、2.52、5.04、10.08 μg/mL),分别精密吸取20μL,注入高效液相色谱仪,测定峰面积。以峰面积Y积分值为纵坐标,常春藤皂苷元的浓度C(μg/mL)为横坐标,绘制标准曲线,常春藤皂苷元的回归方程为:Y=208 596×C-10 088(r=0.999 9),表明常春藤皂苷元进样量在0.252~10.08μg/mL范围内线性关系良好。
2.2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液(浓度为5.04 μg/mL)20μL,按上述色谱条件重复进样6次,测定峰面积,常春藤皂苷元峰面积的RSD为0.24%(n=6)。
2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液在0、2、4、6、8、12 h后,依法测定,常春藤皂苷元峰面积的RSD为2.0%。表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.2.7 重复性试验 称取瘤果黑种草子药材5份,每份约1.0 g,分别精密称定,制备成供试品溶液,测定峰面积,常春藤皂苷元峰面积的RSD为1.3%(n=5)。
2.2.8 加样回收率试验 称取已知含量的瘤果黑种草子药材9份,每份各约0.03 g,分别精密称定,加入常春藤皂苷元对照品溶液(10.08 μg/mL)0.8 mL、1.0 mL、1.2 m L,制备成供试品溶液,进样测定峰面积,计算加样回收率。结果见表1。
表1 加样回收率试验结果(n=9)
2.2.9 样品含量测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20μL,注入液相色谱仪,测定5份药材样品。测定结果见表2。
表2 样品测定结果(n=5)
3 讨论
3.1 本实验建立的薄层色谱鉴别方法,分离度好,显色后斑点颜色清晰。
3.2 瘤果黑种草子中的三萜皂苷以常春藤皂苷元为苷元。由于三萜皂苷极性较大,先用甲醇进行超声提取;根据皂苷在水饱和正丁醇中溶解性较好的性质,再用水饱和正丁醇提取皂苷,然后加酸水解。由于三萜皂苷水解成常春藤皂苷元,极性变小,所以用极性小的有机溶剂氯仿提取常春藤皂苷元。在各步萃取过程中,注意两相之间的静置分层,尤其是第一步水饱和正丁醇萃取时,切勿剧烈振摇,避免乳化现象,使分层不明显,影响含量测定结果的准确性。
3.3 常春藤皂苷元分子结构中无共轭体系,属于末端吸收,紫外吸收较弱。根据文献采用高效液相-二极管阵列检测器,确定检测波长为208 nm。此波长下常春藤皂苷元的峰与其他峰分离良好,峰面积最大,故选择208 nm作为检测波长。
3.4 在含量测定过程中,考虑到常春藤皂苷元处于末端吸收,且甲醇本身就对其测定有干扰,故选择乙腈-0.05%磷酸作为流动相,进行等度洗脱,常春藤皂苷元的峰能与其它相邻峰达到很好的分离,且基线较平稳,峰型好。
[1]中国药典[S].一部.2005:241.
[2]新疆植物志编辑委员会.新疆植物志[M].第2卷第2分册,第1版.新疆:科技卫生出版社,1995:35-36.
[3]倪君君,王喆星,吴立军.瘤果黑种草子化学成分的研究[D].沈阳,沈阳药科大学,2007.
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