水蔓菁滴丸中总黄酮和木犀草素的含量测定

2010-09-17刁海鹏孙体健

中成药 2010年7期

刁海鹏，杜艳，丁红，孙体健

(山西医科大学，山西太原030001)

水蔓菁为玄参科细叶婆婆纳属水蔓菁(Veronica linariifolia)，具有清热解毒、利尿、止咳化痰等作用［1］。主要化学成分为芹黄素、木犀草素苷等黄酮类化合物［2］，现已有用水蔓菁制成的片剂，临床用于治疗慢性气管炎、肺化脓症、咳吐脓血、急性肾炎、尿路感染等疾病［3］。但是片剂存在服用量大，生物利用度低等问题。为满足临床用药的需要，本课题组提取出水蔓菁的有效部位，制备成滴丸(制备方法另文撰述)。本实验对水蔓菁滴丸中总黄酮和木犀草素含量测定方法进行了研究，以希望用总黄酮含量和木犀草素含量对水蔓菁滴丸质量进行控制并为该药制定质量标准提供参考。

1 仪器与试药

仪器:LC-20A高效液相色谱仪 (日本岛津);质谱仪:Quattro Premier Waters—2659(美国Waters公司);紫外分光光度计(上海菁华仪器);760CRT双光束紫外-可见分光光度计(上海精密分析仪器厂);FA1004电子天平(上海分析天平仪器厂);真空干燥箱(DEG-402型天津天宇技术实业有限公司)。

试药:乙腈为色谱纯试剂;磷酸、氯仿、甲醇、甲酸、三氯化铝、醋酸钾均为分析纯;芦丁对照品(中国药品生物制品检定所批号:1521-200401);木犀草素对照品(中国药品生物制品检定所批号:1477-200418);水蔓菁药材，经山西省药检所鉴定为细叶婆婆纳属水蔓菁，产自山西省万荣县。

2 方法与结果

2.1 可见分光光度法测定水蔓菁滴丸中总黄酮含量［4，5］

2.1.1 供试品溶液的配制

对照品溶液的制备:精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品3.1 mg，置50 mL量瓶中，加适量60%乙醇，超声使之溶解，再用60%乙醇稀释至刻度，得对照品溶液(0.062 mg/mL)。

样品溶液的制备:取水蔓菁滴丸15粒，研细，过80目筛，精密称取滴丸粉末0.05 g，置25 mL量瓶中，加60%乙醇适量，超声使之溶解，加60%乙醇至刻度并摇匀。精密量取1 m L，置10 mL量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀即得。

2.1.2 测定波长的选择

精密吸取样品溶液及对照品溶液各1.0 mL，分别置10 mL量瓶中，0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL，0.1 mol/L KAc溶液3 mL，再加60%乙醇至刻度，放置30 min。在200 nm～500 nm范围内扫描得测定波长为410 nm。

2.1.3 标准曲线的制定

分别精密吸取芦丁对照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，各加0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL，0.1 mol/L KAc溶液3 mL，再加60%乙醇至刻度，摇匀，放置30 min，在410 nm处测定吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标，以浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=0.034 9X－0.000 5，r=0.999 9，表明芦丁浓度在 3.1 ～24.8 μg/mL范围内呈良好线性关系。

2.1.4 显色稳定性考察

量取芦丁对照品液2 mL，按2.1.3项下方法，显色10 min后，每隔5 min测其吸光度值。结果表明，前20 min吸收度增大速度快，30～40 min吸光度稳定。故确定显色时间为30 min。

2.1.5 精密度考察

取芦丁对照品溶液，按2.1.3项下方法，重复进行5次试验，结果表明，RSD为0.32%，仪器精密度良好。

2.1.6 重复性考察

精密称取同一批水蔓菁滴丸，按样品溶液的制备方法，平行制备6份供试品溶液，按2.1.3项下方法进行试验，结果表明，RSD为1.1%，本方法重复性良好。

2.1.7 回收率试验

取已知总黄酮含量的水蔓菁滴丸，分别加入高、中、低剂量的芦丁对照品，按样品溶液的方法制备供试液，测定总黄酮含量，计算回收率，结果见表1。

表1 水蔓菁滴丸加样回收率试验结果(n=3)

结果表明:水蔓菁滴丸回收率符合方法学要求，方法准确可行。

2.1.8 水蔓菁滴丸总黄酮含量测定

分别取3批滴丸各15粒，研细，称取滴丸粉末约0.05 g各3份，精密称定，按2.1.1项下方法制备样品溶液，同2.1.3项下操作，得水蔓菁滴丸中总黄酮平均含量为:6.17% ±0.3%。

2.2 样品水解成分结构鉴定

经试验发现制备的水蔓菁滴丸中目前没有可用于高效液相法进行含量测定的特征性成分。但其含有木犀草素苷，经试验发现其水解产物中含有木犀草素。

根据对水解时间，所加水解溶剂的体积、浓度等方面的考察［6］，最终确定水解条件为，精密称取0.5 g水蔓菁滴丸粉末，置50 mL锥形瓶中，精密加入15 mL的2.5 mol/L的盐酸甲醇液，水解1 h，放冷后补足重量，过滤，取滤液0.2 mL，置50 mL量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。对水解液分别进行质谱法、薄层色谱法及高效液相法进行结构鉴定。

2.2.1 质谱法进行样品水解成分结构鉴定［7，8］

从图1～4可知木犀草素对照品与水解样品中结构一致。木犀草素对照品碎片中含有285.13的峰，变换电压后，有285.13、133.08两个峰;而水解样品中，相应的有285.07的峰，变换电压后有285.29和132.98两个峰，与木犀草素对照品相对应，初步确定水解样品中含有木犀草素成分。

图1 木犀草素对照品质谱图1

图2 木犀草素对照品质谱图2

图3 水蔓菁滴丸水解样品质谱图1

图4 水蔓菁滴丸水解样品质谱图2

2.2.2 硅胶薄层鉴别

取木犀草素对照品加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液作为对照品溶液1。取水蔓菁滴丸的甲醇溶液，作为供试液2。取水蔓菁滴丸水解液两份，浓缩，用甲醇溶解作为供试液3，4。吸取上述溶液各5μL，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以CHCl3-甲醇-甲酸(20∶4∶0.8)为展开剂，置预饱和15 min的展开缸内，展开，取出，晾干，喷三氯化铝试液，置紫外光灯(365 nm)下检视发现［9］，供试液3和4斑点中，在与对照品相同比移值位置上显相同颜色的荧光斑点，而供试品2在与对照品色谱相应位置上，无荧光斑点，说明水蔓菁水解液中存在木犀草素。

2.2.3 高效液相法对水解产物进行定性鉴别

用反相高效液相法对水解产物进行定性鉴别后，发现对照品与水解产物在9.8min均有保留峰出现(见图5、图6)。说明水解样品中含有木犀草素。

图5 木犀草素对照品HPLC色谱图

图6 水蔓菁滴丸HPLC图

2.3 HPLC法测定水蔓菁滴丸中木犀草素含量［10］

2.3.1 色谱条件

色谱柱:C18(5μm，4.6 mm×250 mm)(迪马公司);测定波长:350 nm;流动相:乙腈-0.4%磷酸(30∶70);流速:1.0 mL/min;柱温:23℃。

2.3.2 对照品和供试品溶液的制备

对照品溶液的制备:精密称取木犀草素对照品约1.6 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀。制成木犀草素浓度为32μg/mL的对照品溶液。

供试品溶液:精密称取0.5 g水蔓菁滴丸粉末，置于50 mL锥形瓶中，精密加入15 mL的2.5 mol/L的盐酸甲醇液，水解1 h，放冷后补足重量，过滤，取滤液0.2 mL，置50 mL量瓶，用甲醇定容，摇匀，即得。

2.3.3 标准曲线的制定

分别精密量取木犀草素对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，吸取上述溶液各20μL进样，以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归计算，得标准曲线方程:Y=2 863 820.99X－7 169.2，r=0.999 4，试验结果表明:木犀草素在3.2～64μg/mL范围内呈良好线性关系。

2.3.4 稳定性试验

取供试品溶液，分别在0、2、4、6、8 h 进样20 μL，测得样品中木犀草素峰面积值，结果表明:供试品溶液3～8 h内稳定性良好。

2.3.5 精密度试验

精密量取同一份木犀草素对照品溶液20μL，重复进样6次，木犀草素峰面积的RSD为0.6%。

2.3.6 重复性试验

精密称取同一批水蔓菁滴丸6份，按2.3.2项下供试品溶液的制备方法，平行制备6份供试液，分别进样20μL，RSD值为0.6%。

2.3.7 回收率试验

取已知木犀草素含量的滴丸约1.5 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，按2.3.2项下供试品溶液制备方法，制备供试液后，分别加入木犀草素对照品溶液。分别进样20μL，计算回收率，结果见表2。

2.3.8 样品含量测定

精密称取水蔓菁滴丸粉末0.5g3份，按2.3.2项操作，制备供试品溶液，进行含量测定，结果水蔓菁滴丸中木犀草素的含量为0.22%±0.02%。