相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法的建立与评价

266071 济南军区青岛第二疗养院 张立营 孙英姿

250014 济南军区联勤部疾病预防控制中心 赵怀龙 傅兴伦

相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法的建立与评价

266071 济南军区青岛第二疗养院 张立营 孙英姿

250014 济南军区联勤部疾病预防控制中心 赵怀龙 傅兴伦

目的 建立相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法并进行方法学评价。方法 优化最佳相思子毒素多抗包被浓度后建立了相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法，鉴定其检测灵敏度、线性范围、特异性、重复性、回收率等。结果 双抗夹心ELISA方法检测相思子毒素的最小检出限为1 ng/mL，标准曲线在10～100 ng/mL范围内线性良好。血清中加入已知量的标准毒素蛋白，测得平均回收率为89%。结论 本方法检测相思子毒素的可测范围广、特异性强、灵敏度高、变异系数较小，表明其灵敏、特异、可靠。

相思子毒素；双抗体夹心ELISA；方法学评价

相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思子(Abrus precatorius)种子中的一种毒蛋白，与蓖麻毒素(ricin)同为Ⅱ型核糖体失活蛋白(RIP)家族成员，是迄今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一，毒性是普通化学武器的几百倍。相思子毒素已经成为一个成功的天然毒素战剂[1-2]。

由于相思子毒素天然资源比较丰富，制备比较容易，并且相思子毒素中毒后无特异症状，出现症状时已经造成机体严重的器质损害，具备生物毒素武器典型特征，因此历来为外军所高度重视[3]。在2001年世界生物及毒素武器大会(BTWC)上，相思子毒素再次被列入重点核查清单。因此，无论是从核查、应用治疗，还是从防护目的，开展对相思子毒素的研究具有十分重要的意义[4-5]。

本研究利用相思子毒素的多抗和单抗建立相思子毒素的双抗夹心ELISA检测方法，并对检测方法进行了方法学评价。本方法对建立相思子毒素检测试剂盒具有重要的现实意义与应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 相思子毒素、相思子毒素单抗和多抗由本实验室保存，HRP标记的羊抗鼠抗体购自北京华美公司。

1.2 检测过程 ①样品稀释：将相思子毒素进行如下稀释，1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL、0 g/mL。②包被：加入包被液稀释的相思子毒素多抗 (1∶1 000稀释)，100 μL/孔，4℃过夜。甩干包被液，PBST缓冲液洗涤液洗涤3次，3 min/次。③封闭：加入1%BSA封闭液，100 μL/孔，37℃ 60 min，甩干；PBST洗涤液洗涤3次，3 min/次。④加样：加入相思子毒素蛋白，100 μL/孔，每个样品重复3个孔，同时设阳性对照、阴性样品和空白对照，37℃60 min甩干液体，洗涤液洗涤3次，3 min/次。⑤加相思子毒素单抗(1∶4 000稀释)：100 μL/孔。37℃60 min甩干液体，洗涤液洗涤3次，3 min/次。⑥每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体 (1∶5 000)，37℃恒温0.5 h，洗板3次(同前)，每孔加入100 μL底物溶液显色15 min，加入2.0 mol/L H2SO4100 μL终止反应，于酶标仪上读取450 nm吸收波长处的OD值。⑦结果判断：以P(待测样本OD值)/(阴性样本OD值)大于2.1判为阳性。

2 结果

2.1 相思子毒素多抗包被浓度的确定 包被不同浓度相思子毒素多抗的酶标板，在相同条件下进行间接ELISA实验，结果(图1)。当相思子毒素多抗的包被浓度在1.0～50.0 μg/mL范围时，OD450值呈上升趋势；浓度高于50.0 μg/mL时OD450值趋于饱和，故相思子毒素多抗的最佳包被浓度为50.0 μg/mL。

图1 相思子毒素多抗包被浓度的确定

2.2 检测方法的灵敏度和线性范围的确定 将相思子毒素进行梯度稀释，在优化的实验条件下，采用以上双抗体夹心ELISA法测定相思子毒素。得出双抗体夹心ELISA法测定相思子毒素的检出限为1 ng/mL。当相思子毒素的浓度在10～100 ng/mL范围时，相思子毒素浓度与吸光度之间呈线性关系，线性回归方程为y=0.049x+0.407 (即A=0.407C+0.049)，线性相关系数r=0.997 6。在此浓度范围内，相思子毒素可进行定量分析。

2.3 检测方法的特异性分析 用优化的检测体系分别检测相思子毒素、蓖麻毒素和蒴莲根毒素，以验证该检测体系的特异性。结果表明，检测相思子毒素时，随着相思子毒素浓度增加，OD450值呈增加趋势。而检测相思子毒素和蒴莲根毒素时，OD450值与相思子毒素浓度为零时的OD450值接近，表明该方法对相思子毒素具有很好的特异性。

2.4 检测方法的重复性分析 采用变异系数表示法，在同一次测定中对3个浓度水平的样品分别重复测定3次计算批内变异系数。分别测定3个浓度水平的样品在3个不同批次测定之间的变异系数(批间变异系数)，结果(表1)。

表1 重复性测定结果

2.5 回收率的分析 向血液样品中分别添加5、10、20 ng/mL的相思子毒素，每个浓度做3个平行，同时做3个空白对照，测定相思子毒素含量，计算回收率，结果(表2)。

表2 回收率测定结果

3 讨论

相思子毒素是从豆科藤本植物相思子(Abrus precatorius)的种子中提取的一种剧毒性高分子蛋白毒素，其含量约占种子2.8%～3.0%。相思子毒素存在4种同族毒素(isoabrins)，即abrin-a、abrin-b、abrin-c、和abrin-d，相对分子质量介于63～67 ku之间，它们由不同的基因所编码，但同属于一个多基因家族；其中abrin-b、abrin-c由于其B链凝集活性低而只有较弱的细胞毒性作用；而abrin-a、abrin-d则有极强的细胞毒性，小鼠的LD50为0.04 μg/kg，成年人摄入的致死剂量为5.0～7.0 μg/kg，其毒性强度是蓖麻毒素(小鼠LD503.0 μg/kg)的70多倍，已被列为潜在的重要毒素战剂和生物恐怖病原物质之一[6-7]。

目前检测相思子毒素的方法通常有免疫分析法和生物质谱法。生物质谱法需要使用昂贵的基质辅助激光解吸电离质谱或电喷雾质谱，目前普及还较困难。而免疫分析法具有灵敏度高、便于检测生物样品等优点。其中，酶联免疫技术由于操作简便、方法快速、仪器相对简单等优点应用日益广泛[8-10]。

本研究利用相思子毒素的单抗和多抗建立了相思子毒素的双抗夹心ELISA检测方法，能在几小时内检测几十到上百个样品，且不需要复杂的仪器设备，样品预处理简单，检测成本低，检测结果准确可靠，在现场监控和基层检测中有着广阔的推广应用前景。

[1]马惠海，罗胜军，王哲，等.相思子毒素研究进展[J].动物医学进展，2006，27(9)：50-54.

[2]李小兵，谢光洪，周昌芳，等.相思子毒素2a的纯化及鉴定[J].中国兽医学报，2008，28(3)：310-313.

[3]Bhaskar AS，Deb U，Kumar O，et al.Abrin induced oxidative stress mediated DNA damage in human leukemic cells and itsreversalby N-acetylcysteine[J].ToxicolIn Vitro，2008，22(8)：1902-1908.

[4]GarberEA.Toxicity and detection ofabrin and abrin in beverages[J].J Food Prot，2008，71(9)：1875-1883.

[5]李丽琴，郑晓军，陈乐贵，等.相思子毒素多克隆抗体研究[J].防化研究，2001(4)：19-21.

[6]Zemla AT，Ecale Zhou CL.Structuralre-alignmentin an immunogenicsurfaceregion of ricin A chain[J].Bioinform Biol Insights，2008(2)：5-13.

[7]Zhou H，Zhou B，Ma H，et al.Selection and characterization of human monoclonal antibodies against Abrin by phage display[J].Bioorg Med Chem Lett，2007，17(20)：5690-5692.

[8]唐伟国.医学检验诊断试剂的制备与应用[M].上海：上海科学技术文献出版社，1996：12-14.

[9]Lin JY，LeeTC，Tung TC.Isolation ofantitumorproteins abrin-Aand abrin-B from Abrusprecatorius[J].IntJPept Protein Res，1998，12(5)：311-317.

[10]Hedge R，Maiti TK，Podder SK.Purification and characterrization of three toxins and two agglutinins from abrus precatorius seed by using lactamyl-sepharose affinity chromatography[J].Analytical biochemistry，1991，194(1)：101-109.

Objective To establish a double antibody sandwich ELISA method for detection of abrin and analyze the methodology. Methods After the optimal coating concentration of polyclonal antibody of abrin was optimized；a double antibody sandwich ELISA method was established.Detection sensitivity，linear range，specificity，repeatability and recovery rate were assayed.Results The minimal detection limit of abrin was 1 ng/mL and the linearity of standard curve was fine in the range of 10 to 100 ng/mL.The average recovery was 89%when the known amounts of standard toxin protein was added into blood samples.Conclusion This method for detection of abrin is sensitive，specific and reliable because of its wide measure range，high sensitivity，good specificity，small coefficient of variability.

Abrin；Double antibody sandwich ELISA；Methodological evaluation

1005-619X(2010)09-0840-03

青岛市公共领域科技支撑计划项目(09-1-1-28-nsh)

2010-05-25)