烟草与紫苏科间远缘杂种后代化学成分及医药成分的研究

魏克强,杨俊仙,魏治中

烟草与紫苏科间远缘杂种后代化学成分及医药成分的研究

魏克强1,杨俊仙2＊,魏治中3

1山西大学生命科学学院,太原 030006;2山西大学经济与工商管理学院,太原 030006;3山西农业大学农学院,太谷 030801

为利用药用植物资源以缓解吸烟与健康的矛盾,通过创新育种的方法将普通烟草品种 78-04与紫苏进行科间远缘杂交,对选育出的新型烟草稳定品系—紫苏烟的内在化学成分及医药成分进行分析。酯酶与过氧化物酶同工酶分析证实,通过药用植物与烟草基因间的渐渗、交流以及重组,紫苏烟中转入了父本紫苏的遗传物质。烟叶主要化学成分分析显示,紫苏烟具有低糖、中高烟碱的特点,芸香苷的含量比亲本普通烟草品种 78-04提高了 70.4%。气相色谱-质谱联用技术初步分析表明,紫苏烟中含有α-丁香烯、β-丁香烯、芳樟醇和薄荷醇等紫苏挥发油的成分,与紫苏比较其薄荷醇的含量提高了 2倍多;并产生了α-桉醇、香叶烯、桉油精、愈创木奥、α-郁金烯和γ-榄香烯等亲本所没有的医药成分和香料成分。药用植物与普通烟草科间远缘杂交能创造变异、产生烟草新类型,对降低卷烟产品的危害性具有一定作用,紫苏烟在医药和食品等领域也具有很高的综合利用价值。

烟草;紫苏;同工酶;化学成分;挥发油

远缘杂交育种通过引进外源基因可以改良品种、创造变异、形成新物种和新类型。我国药用植物资源丰富,应用中草药的历史悠久,国内已有利用药用植物来改善异科植物品质方面的研究。但是,由于难以克服远缘杂交不亲合性,异科植物间的杂交难度大、成功机率小,迄今获得成功的报道仅有几例:通过复态导入法将水稻 (O ryza sativa ssp.japonica)品种通育 211与柳叶菜科植物月见草 (Oenothera biennisL.)进行远缘杂交,获得了具有育种价值的水稻新种质[1];或采用原生质体融合法获得了葡萄(Vitis viniferaL.)与伞形科植物狭叶柴胡 (B upleurum scorzonerifoliumW illd)的再生杂种植株[2];或利用无性嫁接和有性杂交相结合的创新育种方法分别将普通烟草 (N icotiana tabacumL.)品种与唇形科植物罗勒 (Ocim um bailicumL.)或紫苏[Perilla frutescens(L.)Britt.]远缘杂交,选育出了具有较高工业利用价值的新型烟草稳定品系罗勒烟和紫苏

烟[3,4]。

紫苏为唇形科一年生草本植物,其性温、味辛,具有解表、散寒、下气、消痰和润肺等功效,是目前极具开发利用价值的新资源植物[5]。烟草与中草药同源,为茄科植物烟草的全草,含有多种药食功能的成分,是一种特殊的天然植物药,具有镇静、消肿、解毒、杀虫等功效[6]。烟草制成卷烟后吸食其烟气具有兴奋、提神的作用,然而长期吸烟有害健康,可以引发呼吸系统、心血管系统、恶性肿瘤等疾病。研究表明,中草药在降低卷烟烟气中的有害物质、提高吸食品质等方面具有显著效果[7]。为了充分利用我国传统的药用植物资源以缓解吸烟与健康的矛盾,我们采用无性嫁接与有性杂交相结合的方法,培育出了普通烟草与紫苏科间远缘杂种后代稳定品系—新型烟草紫苏烟 (Zisu tobacco)[4]。本研究对紫苏烟烟叶的主要内在化学成分与挥发性成分进行分析,为其在卷烟、食品和医药等领域的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

药用植物紫苏(父本):种子由中国医学科学院药用植物研究所提供;普通烟草品种 78-04(母本,为山西农业大学培育的烤烟品系)以及紫苏烟:种子由山西农业大学药烟育种研究室提供。试验材料栽培于山西农业大学试验田。

1.2 仪器

垂直平板电泳仪器 (DYY-Ⅲ型,北京六一);高速冷冻离心机 (D-37520,德国 Sigma);紫外-可见分光光度计 (UV-260,日本岛津);凯氏定氮仪 (DDY-2S型,上海华岩仪器设备有限公司);Dionex Summit HPLC (美 国 Dionex);Agilent 6890GC/Agilent 5973MS气相色谱/质谱联用仪(美国Agilent)。

1.3 方法

1.3.1 同工酶分析

参考庚正平等 (1989)[8]垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法。待紫苏、78-04及其杂交后代紫苏烟长到 6～10片幼叶时,分别取幼叶 0.5 g,加入 0.5 mL Tris-柠檬酸缓冲液 (pH 8.9),冰浴中研磨成匀浆,离心,取上清液,加入 0.5 mL 10%(V/ V)甘油,冰箱保存备用。凝胶缓冲液为 Tris-柠檬酸系统(pH 8.9),分离胶浓度 10%,浓缩胶浓度 4%,电极缓冲液为 Tirs-Gly系统 (pH 8.7),电泳时每孔加样 50μL,260 V电泳 4 h。电泳完毕,酯酶同工酶用坚牢蓝醋酸-α-萘酯法染色,过氧化物同工酶用醋酸联苯胺显色法染色。

1.3.2 烟叶主要内在化学成分测定

依据 GB2635-92(烤烟)的分级方法,待烟草成熟采收烘烤后,分别取 78-04和紫苏烟中部叶 C3F 0.5 kg,参考文献[9]的方法分析烟叶主要内在化学成分:总糖采用蒽酮比色法,还原糖采用苦味酸比色法,烟碱采用紫外分光光度法,总氮采用凯氏定氮法,并计算出蛋白质、施木克值、糖碱比和氮碱比。取开花期的无病紫苏叶及上述烟叶,采用高效液相色谱法测定芸香苷的含量[10]。

1.3.3 挥发油成分测定

按 1.3.2的取样方法采集烟叶和紫苏叶样品,新鲜的紫苏叶于阴凉处晾晒 2～3 d、粉碎、水蒸汽蒸馏装置提取、乙醚萃取,萃取液经无水硫酸钠脱水后浓缩回收,得到具有芳香气味的黄色挥发油。烟叶经去梗、干燥(60℃,12 h)、粉碎、进行同时蒸馏萃取,萃取完成后向萃取液中加入适量的无水硫酸钠,静置过夜,将二氯甲烷萃取液浓缩至 1 mL,加入一定量的乙酸苯乙酯(内标)。依据 JY/T 003-1996有机质谱分析方法通则,由吉林大学基础医学院用Agilent GC/MS 6890/5973进行色谱-质谱联机检测,初步对其挥发性成分进行定性、定量分析。

色谱条件:HP-5弹性石英毛细柱 (30 m×320 μm×0.25μm);程序升温:初始温度 60℃,以 5℃/min升温到 260℃;载气为氦气;柱流量 1.0 mL /min;进样口温度为 280℃。质谱条件:EI电离源,电离能量 70 eV;离子源温度 230℃,气质接口温度280℃;扫描范围 30～500 amu;进样量 1μL,分流比 40∶1;定性分析:通过 G1701BA化学工作站数据处理系统 (Agilent),检索N IST98谱图库确定各化学成分。定量分析:通过 G1701BA化学工作站数据处理系统,按面积归一化法进行定量分析,分别得出各化学成分的相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 同工酶谱测定结果

基因决定遗传性状,酶是基因的产物,是基因表达的结果。同工酶在很大程度上能反映植物个体间的遗传差异,利用双亲的同工酶特征酶带是鉴定远缘杂交真伪的有效方法之一。酯酶同工酶谱条带显示,紫苏烟与父本紫苏有一条共同带,而母本 78-04没有;与母本有两条共同带但父本紫苏没有;三者还有一条共同带,共有 12条。过氧化物酶电泳图谱显示共有 9条带,其中,紫苏烟与紫苏有一条共同带,而 78-04没有;三者有一条共同带;紫苏烟还有一条新带(图 1)。结果表明,普通烟草与紫苏的遗传物质分别遗传给了其杂种后代,同时也有一些变异,出现了双亲所没有的新增酶带,这可能是由于紫苏烟获得了父本的遗传物质,异源DNA在细胞中不断地被排斥、分离、重组和最后稳定的过程中导致同工酶变异。

2.2 化学成分测定结果

紫苏烟与亲本烟草比较,其株高、叶片大小、单株叶数、生育期、株型等农艺性状基本相似,只有个别性状倾向于亲本紫苏,如叶呈椭圆形,叶色深绿,叶背面略显红色,腋芽生长势强,叶片较厚,叶及叶脉较脆[4]。取叶片分析显示,紫苏烟的主要内在化学成分与其亲本 78-04之间存在一定差异 (表 1):与 78-04比较紫苏烟的总糖、还原糖、总氮、烟碱、蛋白质及芸香苷的含量分别提高了 51.37%、7.25%、31.55%、75.42%、26.22%和 70.4%;施木克值提高了 19.05%,总糖与烟碱、总氮与烟碱的比值分别降低了 13.75%和 24.68%。对我国 1998-2004年烟草种质资源调制烟叶的统计表明,烤烟中化学成分的平均含量分别为:总糖 23.08%,还原糖19.63%,总氮 2.00%,烟碱 1.99%,蛋白质10.32%,施木克值 2.45,总糖/烟碱 l4.21,总氮/烟碱 1.15[11]。可见,紫苏烟具有低糖、中高烟碱的特点;并且,紫苏烟中芸香苷的含量比我国主要产区槐米的芸香苷含量 (0.278～0.365 mg/g)高 4～5倍[12]。

图 1 幼苗同工酶电泳图谱Fig.1 Isozymes zymogram of offsprings

表 1 紫苏烟主要内在化学成分的测定结果Table 1 Analytical result of chemical components in Zisu tobacco

2.3 挥发油成分测定结果

采用 GC/MS法测定紫苏、78-04和紫苏烟挥发油的成分,分别从中初步确定了 13、22和 30个化合物,总质量分数分别为 55.59%、28.09%和 35.95%,其余成分还有待于进一步分析鉴定。对其挥发性成分进行比较表明 (表 2),紫苏烟主要呈现以下 4个特点:(1)利用烟草与紫苏进行科间远缘杂交,紫苏的部分医药成分遗传给了杂种后代。紫苏烟中转入了α-丁香烯、β-丁香烯、芳樟醇和薄荷醇等紫苏挥发油成分;(2)可能由于双亲基因互作,杂种后代产生了新的医药成分和香料化学成分,主要有α-桉醇、香叶烯、桉油精、愈创木奥、α-郁金烯和γ-榄香烯等;(3)紫苏烟中多数医药成分含量低于父本,少数高于父本。紫苏烟中β-丁香烯、芳樟醇的含量分别比紫苏低 78.47%和 86.54%,而薄荷醇的含量却提高了 2倍多;(4)紫苏烟还含有与 78-04中成分或含量不同的其他挥发性物质。可见紫苏烟含有独特的医药成分,这是普通烟草所不具备的特征特性。

表 2 紫苏烟及其亲本的主要挥发性成分及其含量(相对含量/%)Table 2 Chemical components and relative contents of essential oil from Zisu tobacco(Relative contents/%)

注:“-”表示未检出。Note:“-”:unidentified.

3 讨论

研究表明,一些中草药可以降低卷烟烟气中的有害物质、清除自由基、抑制焦油的致突变性,甚至研制药物型、保健型卷烟[7]。目前,在卷烟的生产中中草药成分的添加工艺基本上是采用三种方式:提取中草药成分在润叶时随料加入,提取中草药的挥发油类物质随香加入或以药物本身的自然形态搀兑在被加工的烟叶中[13]。卷烟燃吸后使中草药的有效成分部分进入吸烟者的呼吸系统,从而起到局部或全身的作用。紫苏烟中烟草传统的化学成分与产生的医药成分处于同一植物体中,这从烟叶原料上就增加了有利于人体健康的医药成分,可以节省大量的中草药,为利用中草药资源以降低卷烟产品的危害性提供了一条新途径。烟叶是满足人们吸食需要的特殊商品,其感官评吸特征是烟叶品质优劣最直接、最权威和最客观的反映。评吸结果显示,紫苏烟表现出香味独特,余味纯净,劲头适中,各种成分比较协调的特性[4]。

我国紫苏资源丰富,分布广泛,其茎叶中的精油含量一般为 0.3%～0.7%,已分离鉴定的挥发性成分达百余种,主要有紫苏醛、柠檬烯、芳樟醇、呋喃酮类衍生物、丁香烯、肉豆蔻醚以及蒎烯、薄荷醇、苯甲醛、丁香油酚等。紫苏精油通常用来治疗哮喘病或制取烟草和食品加工业中的甜味剂-紫苏醛反肟[14]。目前,烟草除作为一种较安全的燃吸材料外,从中分离提取的叶蛋白(LPC)、氨基酸、茄尼醇、烟碱、果胶、绿原酸、芸香苷等在食品和医药领域还具有极高的利用价值[6]。其中,芸香苷是由已糖或戊糖与多酚槲皮素组成的黄酮类化合物,具有多方面的生物活性,主要存在于豆科植物槐 (Sophora japonicaL.)的花蕾 (槐花米)、果实 (槐角)中,也是烟草中含量较高的酚类物质之一,其含量因烟草类型和品种而不同。但是由于槐米资源不足,目前我国芸香苷的生产还不能充分满足市场需求。试验表明,以紫苏为亲本与不同普通烟草品种的杂交后代,均可以大幅度提高烟叶中芸香苷的含量[4],这为提取宝贵的医药原料提供了新的来源。

远缘杂交是引进外源基因创造变异的重要途径,通过药用植物与烟草基因间的渐渗、交流以及重组,可以形成烟草新类型,紫苏烟呈现出含医药成分,香气独特,低糖、中高烟碱等特点,其毒理学实验结果与亲本烟草品种 78-04比较没有显著差异[4]。对烟草的药用价值历代本草和中医药文献均有所论述,而紫苏烟的药理作用尚待深入研究。研究表明,大多数药用植物的有效成分、植物的挥发性物质以及烟草中的烟碱、芸香苷等均是次生代谢产物,而遗传是决定植物次生代谢产物种类的决定因素,次生代谢物的合成途径通常是以代谢频道的形式存在[15]。究竟是由于转入的紫苏遗传物质导致的基因突变还是烟草与紫苏的基因互作对次生代谢物的合成途径进行了调控,这些深层次的机制探索对充分开发利用我国丰富的药用植物资源以及进一步提高烟草的综合利用价值均具有重要意义。

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Chem ical Components andM edicine Ingredients in the Hybrid of Fam ilies between Tobacco andM edicinal Plant Perilla frutescens(L.)Britt

WEI Ke-qiang1,YANG Jun-xian2＊,WEI Zhi-zhong3

1School of L ife Science,ShanxiUniversity,Taiyuan 030006,China;2School of Econom ics and Business Adm inistration,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;3College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China

In order to release the contradiction between s moking and smoker’s health,the distant hybridization between tobacco and medical plantswas expected to incubate the new-type tobacco which included medical ingredients.The hybridization wasmade be tween 78-04(a variety ofN icotiana tobacumL.)and medicinal plantPerilla frutescens(L.) Britt,and a new hybrid descendent,designated as Zisu tobacco,was obtained.Analysis of esterase and peroxidase isozymes in parents and their filial generation proved that heredity substance in medical plantPerilla frutescens(L.) Britt.was introduced into Zisu tobacco.The results of the analysis of chemical components showed that Zisu tobacco had characteristics of low-sugar,middle or high nicotine content,and the contentof rutin increased by 70.4%comparedwith that in female parent tobacco.Chemical constituents of the volatile oilwere extracted and preliminarily analyzed by GC/ MS.The results revealed that the contents of essential oil inPerilla frutescens(L.)Britt,such asα-caryophyllene,βcaryophyllene,linalool andmenthol,was introduced in Zisu tobacco,and the contentofmenthol in itwas two t imes higher than inPerilla frutescens(L.)Britt.Many new medicine ingredients and flavor componentswere found in Zisu tobacco, such asα-eudesmol,myrcene,eugenol,guaiazulene,α-cureumene andγ-elemene.This study indicated that distant hybridization between tobacco andPerilla frutescens(L.) Britt could induce variation and generate new-type tobacco, which had important role not only in reducing harmfulness in cigarette but also in the comprehensive utilizations in food and phar maceutical fields.

tobacco;Perillafrutescens(L.) Britt; isoenzyme;chemical components;volatile oil

Q946.91;R284.1;S572

A

1001-6880(2010)05-0801-06

2009-03-24 接受日期:2009-07-06

教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(200801081012);国家烟草专卖局重点科技项目(110199901005);山西省科技产业化环境建设计划项目(2006071033);山西省人才引进与开发专项资金资助项目(2008)

＊通讯作者 Tel:86-351-7018206;E-mail:kqwei@sxu.edu.cn