灰树花胞外多糖对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用

1 仪器与材料

1.1 样品制备

灰树花菌种经摇床培养得发酵液,之后经过醇沉,脱脂,脱蛋白,脱色,透析,冷冻干燥等一系列的处理得到 GFP。所制得的 GFP是白色粉末,易溶于水,且是含杂质较少糖蛋白缀合物。灰树花胞外多糖是分子量范围较大的多糖,分子量范围大约在几万到几十万。根据苯酚-硫酸法检测其中性糖含量为 58.08%±0.37%。

1.2 实验动物

昆明种系实验小白鼠,由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供,实验动物许可证号: SCXK-(军)2007-004。

1.3 主要试剂和仪器

丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒 (中生北控生物工程制品有限公司),丙二醛、过氧化氢酶等测定试剂盒 (南京建成生物工程制品有限公司)。

Ther mo酶标仪;LEI CA RM 2015组织切片机(浙江金华市科迪仪器设备有限公司);KD-H烘片机(浙江金华市科迪仪器设备有限公司);KD-P摊片机(浙江金华市科迪仪器设备有限公司);721可见紫外分光光度计(上海光谱仪器公司);Kendro冷冻离心机。

2 实验方法

2.1 化学性肝损伤动物模型建立

肝损伤剂:用食用色拉油配制浓度为 0.2%的四氯化碳油溶液。

损伤方法:浓度为 0.2%的 CCL4油溶液腹腔注射剂量[3]为 10 mL/kg,即 0.2 mL/20 g,腹腔注射(ip)一次。

2.2 实验方法

健康昆明小鼠常规饲养,称重后随机分为生理盐水对照组 (control)、CCL4模型组、GFP高剂量组(300 mg/kg体重)、GFP中剂量组 (200 mg/kg体重)、GFP低剂量组 (100 mg/kg体重)、联苯双酯阳性组 (150 mg/kg体重),每组 8只。对照组以生理盐水 0.1 mL/10 g灌胃,连续灌胃给药 15 d,末次给药 2 h后,用 0.2%CCL4色拉油 ip进行损伤,禁食24 h,断头取血。3500 r/min离心 8 min得血清,测血清丙氨酸氨基转移酶,天门冬氨酸氨基转移酶和过氧化氢酶活力,取肝脏 1500 mg按 1∶9比例加入预冷生理盐水在冰浴中匀浆,测定丙二醛含量和乳酸脱氢酶活力。

2.3 生化指标测定方法

2.3.1 血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT):连续监测法。丙氨酸氨基转移酶作用于由 L-丙氨酸及α-酮戊二酸组成的底物,生成丙酮酸及 L-谷氨酸,丙酮酸与NADH作用,生成L-乳酸和NAD+,340 nm处比色。

2.3.2 血清天门冬氨酸氨基转移酶 (AST):连续监测法。天门冬氨酸氨基转移酶作用于由 L-天门冬氨酸及α-酮戊二酸组成的底物,生成 L-谷氨酸和草酰乙酸,草酰乙酸与NADH作用生成L-苹果酸和NAD+,340 nm处比色。

2.3.3 过氧化氢酶(CAT):过氧化氢酶(CAT)分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止,剩下的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物,在405 nm处测定其生成量,可计算出 CAT的活力。

2.3.4 肝匀浆丙二醛:比色法。过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)与硫代巴比妥酸(T BA)缩合,形成红色产物,532 nm处比色。(5)乳酸脱氢酶(LDH):乳酸脱氢酶(LDH)能催化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸与 2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙,在碱性溶液中呈棕红色,通过比色可求出酶活力。

2.4 数据统计处理

实验数据以x±sd表示,组间比较用t检验,P＜ 0.05表示差异有显著性,P＜ 0.01表示差异有极显著性。

3 实验结果

3.1 GFP对小鼠血清ALT和AST的影响

由表 1知,CCL4肝损伤模型组小鼠血清 ALT和AST明显高于对照组,肝损伤模型成立。GFP3个剂量对因肝损伤引起的ALT,AST升高具有显著的抑制作用,并且基本呈剂量效应。

表 1 GFP对肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响Table 1 Effect of GFP on serum ALT and AST in mice of liver Injury

3.2 GFP对小鼠血清过氧化氢酶(CAT)的影响

由表 2知,CCL4肝损伤模型组小鼠血清 CAT明显低于对照组,肝损伤模型成立。GFP 3个剂量对因肝损伤引起的 CAT降低具有显著的提高作用,并且基本呈剂量效应。

3.3 GFP对小鼠肝匀浆中丙二醛(MDA)的影响

由表 3知,小鼠肝损伤后,其肝脏中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)的含量显著提高,预先给予GFP,可降低 CCL4肝损伤后引起的脂质过氧化作用,抑制了MDA的升高,并且基本呈剂量效应。

表 3 GFP对肝损伤小鼠肝匀浆中丙二醛(MDA)的影响Table 3 Effect of GFP onMDA of hepatic homogenate in mice of liver injury

3.4 GFP对小鼠肝匀浆中乳酸脱氢酶(LDH)的影响

由表 4知,小鼠肝损伤后,其肝脏中乳酸脱氢酶活力显著提高,预先给予 GFP,可降低 CCL4肝损伤后引起的脂质过氧化作用,抑制了乳酸脱氢酶活力的升高,并且基本呈剂量效应。

表 4 GFP对肝损伤小鼠肝匀浆中乳酸脱氢酶(LDH)的影响Table 4 Effect of GFP on LDH of hepatic homogenate in mice of liver injury

3.5 小鼠肝脏组织的病理变化

正常对照组小鼠肝细胞结构组织正常,肝细胞以中央静脉为中心呈细胞索排列整齐,细胞核分布均匀,呈球形;肝损伤模型组小鼠肝组织损伤严重,肝细胞排列紊乱,中央静脉区有大量炎细胞浸润现象,多数肝细胞呈细胞水肿,气球样变[4]可见明显的点状、灶状坏死;GFP剂量组细胞排列较为整齐,中央静脉区很少的炎细胞浸润现象,肝小叶较为清晰,基本呈现细胞索排列,很少看到坏死病灶,有少许变性。

图 1 GFP对 CCL4所致小鼠急性肝损伤组织病理学影响(HE,×40)Fig.1 Effect of GFP on histopathology ofmice with acute hepatic injury induced by CCL4(HE,×40)

4 讨论

GFP能降低 CCL4升高的血清 ALT和 AST水平,显著减轻肝细胞变性坏死与炎细胞浸润,提示GFP具有抑制炎症反应和肝脏保护作用。GFP低、中、高剂量组的抗 CCL4肝损伤的作用相比较而言,虽然高剂量组的效果比中剂量组高出的部分不是很明显,但也可以说明本试验基本呈现剂量效应,如果从用药量和经济效益上考虑,中剂量也能发挥较好的作用。CCL4造成的肝损伤是典型的自由基损伤,可显著降低CAT酶活性,升高MDA、LDH酶活力水平。同时,激活 Kupffer细胞及中性粒细胞,影响肝细胞的DNA合成和分裂,引起急性肝损伤[5]。

GFP能显著升高 CAT酶活性,降低MDA、LDH酶活力水平,提示 GFP对肝损伤的保护作用与其清除自由基、提高抗氧化酶活性有关。

总之,本研究表明 GFP对 CCL4诱导的化学性急性肝损伤动物模型具有明显的保护作用。据报告[6]CCL4进入人体经肝细胞色素 P-450的代谢激活后。生成三氯甲基(·CCL3)自由基,迅速引起生物膜脂质的过氧化,从而破坏了生物膜结构和正常生理功能,导致细胞内ALT和 AST外溢,使血清中ALT与AST活性升高[7]乃至肝细胞坏死,也有人认为 CCL4经代谢激活后生成的自由基与细胞膜的大分子物质进行不可逆结合,破坏了肝细胞结构和功能。初步的研究发现,其机制可能与清除自由基、提高抗氧化酶活性等作用有关,进一步深入研究灰树花多糖的抗肝损伤作用可望将其开发为新的治疗肝病药物。

致谢:本文在实验的设计、操作及文章的撰写过程中,得到了天津科技大学营养与卫生研究室曹小红老师,王春玲老师,鲁梅芳老师,曾斌老师和侯丽华老师的大力支持,在此诚挚的谢谢他们!

1 Bian DP(卞冬萍),Yang ZQ(杨振泉),Fang WM(方维明).Advance in the study on characteristics of extracellular polysaccharide fromGrifola frondosa.M od Food Sci Tech(现代食品科技),2005,12:247-250.

2 ZhengM(郑敏),Xu AQ(徐爱芹),Bao CY(鲍翠玉),et al.Compared protective effect of angelica sinensis polysaccharide and allitridi on carbon tetrachloride induced liver injury in mice.W orld Chinese J D ig(世界华人消化杂志), 2003,11:348-349.

3 WangQZ(汪求真),Ma AG(马爱国),Sun YY(孙永叶),et al.Effects of high dose vitamine on antioxidative function and DNA damage in rats.Acta Nutrimenta Sinica(营养学报),2005,27:467-470.

4 Xiao G(肖刚),WangQ(王勤).Protect ive effectofmogrosides on exper imental liver injury in mice.2.China Phar m(中国药房),2008,3:163-165.

5 PalmesD,Spiegel HU.Animalmodels of liver regeneration.B iom aterials,2004,25:1601-1611.

6 Yang JX(杨建雄),Yuan JF(原江峰),Li FR(李发荣). The anti-oxidative effectof persimmon leaf flavonoidin vitro. Acta Nutrimenta Sinica(营养学报),2003,25:215-217.

7 Lee TY,Ma iL M,Wang GJ,et al.Protective mechanism of

salvia miltio rrhiza on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats.J P har m acol Sci,2003,91:202-210.

Protective Effect of Exo-polysaccharides Produced byGrifola frondosaon Carbon Tetrachloride Induced L iver Injury in M ice

CAO Xiao-hong,ZHU Hui,WANG Chun-ling,LU Mei-fang,ZENG bin＊,WANGAi-hua
Tianjin University of Science&Technology,College of Food Engineering and B iotechnology Tianjin key Laboratory of food Nutrition and Safety,Tianjing 300457,China

Acute hepatic injurymodelwas induced by CCl4in mice to study the protective effect of exo-polysaccharides produced by Grifola frondosa(GFP)on experimental liver injury in mice.The activities of alanine aminotransfe(ALT), aspartate aminotransferase(AST),catalase(CAT)in serum,lactate dehydrogenase(LDH),and the content of maleic dialdehyde(MDA)in the liver tissue were investigated,and the histological changes of liver were observed.GFP could decrease the serum activities ofALT,AST,and the activity ofLDH,MDA content in liver tissue,but increase the serum activities of CAT ofmice with acute hepatic injury induced by CCl4,and it could lessen the histological changesof liver. Consequently,we can see clearly that GFP showed protective effect on mice with acute hepatic injury.

Grifola frondosa;exo-polysaccharides;carbon tetrachloride;acute hepatic injury

Q485

1001-6880(2010)05-0777-04

2009-06-22 接受日期:2009-11-11

＊通讯作者 Tel:86-22-60601428;E-mail:zengbin@gmail.com