兔不完全性截瘫损伤脊髓血管内皮生长因子（VEGF）免疫组化阳性表达的动态变化※

刘 洁 刘 盟 王 群湖南中医药大学第一中医临床学院（4008） 中南大学00届外语毕业生（400）

兔不完全性截瘫损伤脊髓血管内皮生长因子（VEGF）免疫组化阳性表达的动态变化※

刘 洁1刘 盟2王 群1
1湖南中医药大学第一中医临床学院（410208） 2中南大学2010届外语毕业生（410012）

目的 探讨兔不完全性截瘫后损伤脊髓血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor ,VEGF）免疫组化阳性表达的动态变化，探讨其在脊髓损伤过程中的作用。方法 采用压迫法造成不完全截瘫模型，伤后6h、7d、15d、取损伤脊髓组织3mm，用免疫组织化学S-P法染色，并用彩色图象分析系统进行图像分析。结果 脊髓损伤VEGF表达变化分为两个阶段：第一阶段表达为最高峰值伤后6小时。第二阶段表达峰值为伤后15d。结论 VEGF可为脊髓损伤的时间提供诊断依据: 伤后6h为脊髓损伤的最高峰期主要是脊髓出血，炎细胞浸润，脊髓水肿时期，VEGF可为脊髓损伤提供治疗依据：15d时，VEGF增加血管通透性，改善血液循环，增加生殖与迁移，主要是保护作用，促进脊髓损伤的愈合，加快修复部位主要是灰质部位. 治疗上可大量使用活血化淤药。

兔不完全截瘫；VEGF阳性表达动态变化；脊髓神经损伤时间的诊断治疗依据

截瘫，尤其是不完全性截瘫，已成为临床的常见病和疑难病。血管生长因子与神经生长因子一样，为神经血管再生的重要物质。血管内皮生长因子的促血管新生、促神经再生的作用，已开始运用于创伤愈合的领域中，在大脑弥漫性损伤中的表达已有资料报道①，在脊髓损伤中尚未见资料报道。我们对不完全性截瘫兔的损伤脊髓部位的VEGF阳性表达作了动态观察，现报道如下：

1 材料与方法：

1.1 材料 ①实验动物与分组：由湖南中医学院日本大耳白兔饲养中心提供健康雄性日本大耳白兔40只，体重2.0～2.5kg。随机分为非脊髓损伤组。造模损伤6h组、7天组、15天组，每组10只。②兔不完全性截瘫模型的制备采用压迫法③造成不完全性脊髓损伤。对照组与模型组常规麻醉，显露第七腰椎间孔切断黄韧带，插入麻醉导管胶囊，并用皮肤尾线固定，但不注入典必乐，不予压迫。24h后拔掉导管。

在模型组形成6h、7d、15d时，空气栓塞分批处死大耳白兔。电镜液固定损伤脊髓部位，取3mm长，损伤脊髓用10%的中性福尔马林固定液再固定，常规石蜡包埋切片。

1.2 主要试剂 兔抗兔VEGF单克隆抗体、SP免疫组织化学试剂盒，DAB显色剂，由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 VEGF免疫组化染色 ①石蜡切片常规脱蜡至水；②10%过氧化氢37℃孵育10min，微波抗原修复；③羊血清孵育10min，滴加一抗4℃过夜；④滴加二抗37℃孵育30min；⑤滴加三抗37℃孵育30min；⑥DAB显色苏木素复染；⑦脱水透明封片。

1.3.2 图象分析和统计处理 应用美国产Optimas 6.51彩色图象分析系统（湖南中医药大学中医诊断研究所提供），40×10倍视野显微镜下对VEGF免疫组织化学染色阳性反应物进行定量检测，分别测定损伤脊髓灰质（前、后角，灰质联共5个视野）和白质（前后索侧索共6个视野），灰、白质共11个视野阳性信号数（Var•of Cray）和灰度（Mean Gray）。

用SPSS.11.5统计软件进行方差分析和q检验，P＜0.05视为两组有显著性差异。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色显微镜下结果 如图片

2.2 免疫组化图像分析阳性反应灰度与信号数变化 如表1。

表1 脊髓灰、白质不同阶段的动态变化 n=照相张数

如表1所示，正常组VEGF阳性信号的灰度主要表达在脊髓白质（前后侧索），阳性表达灰度明显比灰质高，但颗粒含量差异不显著。

模型组灰质部位（前角、后角）VEGF阳性信号灰度6h与（非脊髓损伤组）无显著差异，但阳性信号数开始显著升高，呈4个时相的最高峰。6h损伤脊髓灰质、白质的灰度与信号数比较显著差异。白质部位灰度明显呈下降趋势，但与正常组无差异，信号数明显升高呈4h相的最高值。

7d时灰质部位（前角、后角）阳性信号灰度较正常组，显著升高，表现为四个时相的最高峰，但阳性信号数已开始下降，较6h出现显著差异。仍明显高于正常组。白质灰度亦明显高于6h时，阳性信号数开始显著下降，明显低于6h时高于正常组。7d时灰白质、灰度与信号数比较均无显著差异。

15d时灰质部位（前角、后角）阳性信号灰度，显著低于7d时灰度，但仍明显高于6h组和非脊髓损伤组，但信号数又呈升高相，出现四个时相的次高峰。白质部位阳性信号灰度呈下降趋势明显低于7d时，信号数又开始升高，出现四个时相的次高峰。灰质与白质灰度比较呈现显著差异。

3 讨论

VEGF在脊髓损伤中的作用：目前，有关VEGF在脊髓损伤中的表达未见详细资料报道，但在脑损伤修复和脑缺血中有大量资料报道。大鼠弥漫性脑损伤中，在伤后6h阳性信号数达峰值，主要部位在神经元内[1]。与我们所测的资料相一致。本项观察的第一个峰值也在6h，在灰质白质均有表达，均与非脊髓损伤组出现显著差异。脊髓损伤7d时灰、白质灰度出现最高值，而颗粒数相对减少这与损伤组织的自然凋亡有关。至15d时颗粒含量出现次高峰，灰质灰度较7d时又开始下降，白质的灰度变化不明显，从损伤以前15d来看，VEGF表达活跃主要反应在灰质部位。

关于VEGF的神经保护方面的研究近几年来发展迅速，VEGF是通过内皮细胞上的特异性受体发挥作用，Kilic等[2](2006)发现缺氧时VEGF主要通过其受体(特别是VEGF-2受体)激活P13K/Akt pathway起到保护神经及增加血管通透性的作用。目前发现至少有3种受体与VEGF有关，包括KDR/FLK、FLT1、FLT4。VEGF通过受体结合，增加血管通透性和促进新生血管形成，伤后6h为脊髓损伤的最高峰期主要是脊髓出血，炎细胞浸润，脊髓水肿时期。这个表现与损伤脊髓血管内皮细胞生长因子阳性信号数呈高峰状态相一致，亦和光电镜的表现相一致。一方面VEGF主要是增加血管通透性破坏血脑脊屏障，促进脊髓水肿加重脊髓损伤，另一方面增加脊髓血管通透性，是为促进新生血管形成，改善脊髓血液循环，促进脊髓再生做准备。VEGF第二个高峰是在损伤的15d，增加血管通透性，改善血液循环，增加生殖与迁移，主要是保护作用，促进脊髓损伤的愈合，加快修复部位主要是灰质部位。因为15d灰质部位的灰度又开始出现差异与非脊髓损伤组表现一致。VEGF促进血管生长，增加血氧供应，从而促进细胞存活；VEGF也可直接作用于神经元，抗细胞凋亡、降低氧化应激、调节离子通道、抑制突触传递和细胞兴奋性，以及促进神经元再生等。Krum和Khaibullina(2003)[4]发现VEGF是大脑修复中的中心环节，它是血管内皮存活和增生的关键。梅欣明等使用当归注射液治疗宫内缺氧大鼠,可上调大鼠大脑皮质VEGFmRNA的表达. 脊髓损伤15d时,治疗上可大量使用活血化淤药。

综上所述，VEGF四个时相的表现是诊断脊髓损伤分析的高精确灵敏指标，可望为脊髓损伤形成不同阶段动态变化时间和修复时间提供参考，并为临床治疗提供指导意义。

[1] 李梅,廖志钢,王欣,等.大鼠弥漫性脑损伤中血管内皮生长因子表达变化的实验研究[J].法律与医学杂志.2002,9(2):96.

[2] 刘洁,胡湘明,刘光国,等,建立兔急性压迫型不完全性截瘫模型的实验研究[J].湖南中医学院学报2003,23(5):1.

[3] kilic E,KiLic U,Wang Y,et al. the phosphatidylinositiol-3 kinase/akt pathway mediates VEGF’s neuroprotective activity and induces blood brarrier permeability after focal cerebral ischemia[J],FASEBJ, 2006,20(8)1185-1187

[4] Krum JM,Khaibullina A. Inhibition of endogenbous VEGF impedes revasc ularization and astroglial prolifenration:roles for vegf in brain repair[J].Exp Neurol, 2003,181(2):241-257.

[5] 梅欣明,刘敦玉,赵峰等.当归对宫内缺氧新生大鼠大脑皮质神经元与VEGFmRNA表达的影响[J].四川动物,2010.vol29(1),2010.

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.18.177

1672-2779（2010）-18-242-03

国家自然科学基金资助项目[No：399709260]

2010-05-28）