减毒活菌卡介苗对哮喘TLR4表达的影响

张雅琴 眭建

哮喘存在有气道高反应性、Ig-E调节和特异性反应基因。Toll样受体是在哺乳动物中发现的与果蝇有同源性的蛋白，命名为TLR，最初发现的TLR4是目前研究最多的［1］。研究证实，BCG其分枝杆菌脂蛋白能与巨噬细胞上Toll样受体结合，促进巨噬细胞产生IL-12、IFN-γ，抑制IL-4、IL-5的产生，从而纠正哮喘中Th1/Th2亚群数目和(或)功能失衡［2］。本实验意在研究BCG对哮喘小鼠模型中肺组织TLR4的影响，为临床哮喘治疗提供新的研究方向及思路，并将发现以TLRs和其信号途径作为靶点去治疗、干预多种疾病的新方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 昆明种小白鼠、卵白蛋白(OVA，GradeⅡ)、减毒活菌卡介苗(BCG)、抗TLR4单克隆抗体、抗GAPDH单克隆抗体、HRP标记的小鼠IgG抗体等。

1.2 实验动物的分组及致敏模型制备 实验动物随机分为三组，分别为空白对照组、哮喘发病组和BCG干预组，每组10只小鼠。哮喘发病组：第1、7、14天腹腔注射0.08%OVA致敏，每次0.2 ml，Al(OH)3作为免疫佐剂。第15天开始雾化激发;BCG干预组：哮喘模型的建立同哮喘发病组，在每次致敏前1 d和最后雾化激发1 h内BCG皮内注射再次干预，每次剂量为0.025 mg;空白对照组：用生理盐水代替OVA。所有小鼠在最后一次激发24 h后获取标本。

1.3 小鼠肺组织TLR4蛋白的Western Blotting检测 取各组实验小鼠肺组织提取总蛋白，测定浓度。各组蛋白样品SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜上。PVDF膜经封闭2 h后，用稀释后的TLR4单克隆抗体，4℃孵育过夜。再进一步与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育后，滴加化学发光底物，X-光胶片感光检测蛋白信号。

1.4 统计学方法 所有实验结果采用SPSS10.0软件进行统计分析，计量数据以()的形式表示。组间差异采用t检验。

图1 各组小鼠肺组织中TLR4蛋白表达的Western Blotting鉴定

2 结果

TLR4蛋白在空白对照组的肺组织中仅有微量的表达，哮喘发病组中TLR4蛋白的表达量较对照组略有升高，而BCG干预组中TLR4蛋白的表达量较前两组均有显著的增强(灰度分析数据未显示)。

3 讨论

BCG为结核杆菌的减毒活疫苗，其主要成分是卡介苗核糖核酸。研究证实［3］，TLR4的配体结合TLR4后，通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细胞内，产生复杂的级联信号反应，其中TLR4-NF-KB信号途径参与细胞免疫应答、炎性反应和抗凋亡相关基因的转录是细胞免疫学领域的研究热点。但BCG是否也能通过TLR4途径介导并激活Th1型免疫反应尚不清楚。

我们通过实验发现经BCG干预后，TLR4基因表达量与空白对照组以及哮喘发病组相比均有显著升高。BCG可能是通过刺激TLR4表达上调，进而调节Th1/Th2平衡，在哮喘发病的治疗中发挥重要作用。而关于BCG作为TLR4的配体如何发挥功能仍需进一步的实验研究验证。

［1］Mikko Hallman，Mika R met，et al.Toll-Like Receptors As Sensors Of Pathogens.Pediatric Research，2001，50(3).

［2］I.S.Choi，Y.I.Koh.Effects of BCG revaccination on asthma.Allergy，2003，58：1114-1116.

［3］An De Creus，Masanori Abe，et al.Low TLR4 Expression by Liver Dendritic Cells Correlates with Reduced Capacity to Activate Allogeneic T Cells in Response to Endotoxin1.The Journal of Immunology，2005，174：2037-2045.