反相高效液相色谱法同时快速测定黄酒和葡萄酒中有机酸的含量＊

吕旭聪,黄志清,黄若兰,黄彬红,饶平凡,倪莉

(福州大学,食品科学与技术研究所,福建福州,350108)

反相高效液相色谱法同时快速测定黄酒和葡萄酒中有机酸的含量＊

吕旭聪,黄志清,黄若兰,黄彬红,饶平凡,倪莉

(福州大学,食品科学与技术研究所,福建福州,350108)

建立了利用反相高效液相色谱法同时快速测定黄酒和葡萄酒中酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸等 7 种有机酸的方法。采用的色谱柱为 X B-C18(5μm,150 mm×4.6 mm),检测器为紫外检测器,波长210 nm;确定的最优色谱条件是:0.02 mol/L KH2PO4-乙腈(98∶2),pH 2.3,流速1.0 mL/min,柱温30℃,进样量10.0μL,冲洗方式为等度洗脱。利用此方法分析测定有机酸的工作曲线线性关系良好,回收率在83.17%～117.3%,变异系数在3.1%～5.8%。利用研究所构建的反相高效液相色谱法能够快速地对黄酒和葡萄酒中的有机酸进行测定,满足企业对产品质量进行实时监控。

反相高效液相色谱法(RP-HPLC),同时分析测定,黄酒,葡萄酒,有机酸

在食品工业中,不少食品和饮料都与有机酸有关,这些有机酸和其他香味成分一起,赋予了食品一定的口感。俗话说:“无酸不成酒”,说明酸在酒中有着重要的作用[1-4]。实际上酸是酒体的重要组成部分,同时各种有机酸又是酒产香的前体物质:酸能有效增强酒的浓厚感,降低甜度,并且具有缓冲、协助其他香味成分的作用[5-6]。然而,酒中有机酸种类和含量也并不是越多越好,因此有必要构建一种快速分析酒中有机酸含量的方法。

有机酸的检测方法有很多种[7-10],但是这些方法一般要进行预分离、衍生化等繁琐的前处理,而且能达到同时分离的有机酸种类较少,目前最为成熟的技术就是高效液相色谱技术。近些年利用高效液相色谱法测定有机酸的报道较多[11-13],研究大多利用高效液相色谱法测定葡萄酒中的有机酸含量[14-15]。反相高效液相色谱法(RP-HPLC)广泛用于测定有机酸,不仅简单快速,且选择性好,准确度高。试验中采用反相高效液相色谱替代离子交换色谱同时分离7种有机酸,对包括流动相的组成、流动相pH等对分离效果具有影响的参数等进行了优化,建立了适合有机酸分离的优化参数,并对几种黄酒和葡萄酒中有机酸的类型及含量进行定性、定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料

国优名酒“鼓山”福建老酒、古越龙山陈年花雕、3年陈会稽山绍兴花雕酒、惠泽龙印象闽派黄酒(3年)、惠泽龙闽派黄酒(10年)、青红酒、闽乐青酒、闽乐红8年花雕黄酒、长城干白葡萄酒(2000年)、张裕精品干红葡萄酒(1995年)。以上产品均为市售产品。

1.2 仪器与试剂

仪器:日本岛津LC-3A型高效液相色谱仪;XBC18色谱柱;SPD-1紫外分光光度检测器;PB303-E电子天平(梅特勒-托利多仪器公司);pHB-3便携式pH计(上海伟业仪器厂);SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司);5415R型台式高速离心机(eppendorf公司)。

试剂:标准品酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸均为国产分析纯;磷酸二氢钾和磷酸为分析纯;配制试剂所用的水为经Milli-QⅡ纯水处理装置处理过的超纯水。

有机酸标准液的制备:酒石酸 0 .5000 g,苹果酸0.5000 g,柠檬酸 0 .5000 g,琥珀酸0.5000 g,甲酸0.44 mL,乙酸0.5000 mL,乳酸0.425 mL定容于100 mL容量瓶中,所配溶液均经 0 .45μm微孔滤膜过滤,水为超纯水。

1.3 色谱分析条件

色谱柱:XB-C18,5μm,150 mm×4.6 mm;流动相为0.02 mol/L KH2PO4-乙腈(98∶2),用磷酸调pH值至2.3;流速1.0 mL/min;紫外检测波长:210 nm;柱温:30℃;进样量:10.0μL,冲洗方式为等度洗脱,峰面积用外标法定量。

1.4 实验方法

1.4.1 检测波长的选择

为考察检测波长对有机酸检测灵敏度的影响,用190～400 nm紫外光对草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸及琥珀酸分别进行扫描,各酸在210 nm左右均有较大吸收峰,最大吸收波长均在210 nm左右,所以把检测波长暂定在210 nm。

1.4.2 有机酸的分离

在反相C18柱上以KH2PO4-H3PO4缓冲液为流动相,观察流动相中KH2PO4浓度、流动相pH值、流速对7种有机酸分离的影响,选择适宜的分离条件,测定各有机酸的保留值。

1.4.3 样品处理与分析

样品预处理:取10 mL酒液,离心(10000 r/min,15 min)2次,除去水不溶物,然后用0.45μm孔径的滤膜过滤即得到待测液。

1.4.4 定性与定量

在相同的色谱条件下,将样品色谱图与有机酸标准液进行对照,根据确定样品中的各有机酸峰的保留时间来进行定性。还可以在样品液中加入一定量的有机酸标准溶液,观察在相同的保留时间下,峰高是否增加,以此来进行定性分析;在标样与样品进样量相同的情况下,应用外标法定量,可计算出样品中各有机酸的含量。

2 结果与讨论

2.1 HPLC色谱条件优化

2.1.1 流动相的选择

常 用 的 缓 冲 液 以 KH2PO4、NaH2PO4及(NH4)2HPO4居多,这3种缓冲溶液均可成功实现复杂体系有机酸的分离,此外也有采用H2SO4溶液分离有机酸的报道。本研究选择浓度为0.02 mol/L的磷酸二氢钾-乙腈(98∶2)pH值2.3和0.005 mol/L的H2SO4溶液pH值2.0为流动相,对7种有机酸混合标准样进行分离,分离图谱见图1和图2。试验结果表明,采用0.02 mol/L的磷酸二氢钾-乙腈(98∶2)作为有机酸分离的流动相分离效果较好,图1中有机酸的出峰顺序是:酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸。而采用pH值2.0的0.005 mol/L H2SO4溶液为流动相时,有机酸出峰明显少,而且峰形不对称,甚至峰与峰之间没有达到基线分离,无法进行定性定量分析,这可能跟色谱柱的类型及分离能力有一定的关系。

图1 七种有机酸标样的色谱图

图1有机酸的出峰顺序能够与理论相吻合[16],在RP-HPLC中,被分离组分极性越弱,与键合相表面烷基之间色散力就越强,容量因子K就越大。相反,极性越强,即分子含羟基数和羧基数越多,与流动相溶剂分子形成的氢键就越强,K就越小。柠檬酸和琥珀酸都含有2个可与键合相表面烷基产生色散力的亚甲基,且柠檬酸的亚甲基的2个亚甲基被带有部分正电荷的碳原子隔开,故其烷基间的色散力小于琥珀酸,故实际K的顺序为:酒石酸<甲酸<苹果酸<乳酸<乙酸<柠檬酸<琥珀酸。

图2 七种有机酸在流动相为0.005 mol/L H2SO4溶液(pH值2.00)的色谱图

2.1.2 流动相最佳pH值

流动相的pH值对各种有机酸的分离效果具有十分重要的作用。所谓离子抑制法就是,在较低的pH值抑制酒中有机酸的电离,其大多数有机酸以有机酸分子的形式存在于酒中,从而使其能在C18柱中有较好的保留。流动相pH值选择的原则一般根据有机酸的pKa值来定。酒中的有机酸均为弱酸,在水溶液中存在着解离平衡,解离程度受溶液pH值的影响。考虑到色谱柱要求使用的流动相pH值范围为2.0≤pH≤9.0,将缓冲液的pH分别用磷酸调至2.0,2.3,2.5和2.8,经4种不同流动相进行分离。结果表明,随着pH值的增大,各有机酸的保留时间减少了,特别是出峰比较后面的柠檬酸和琥珀酸随着pH增大,保留时间减少得比其他几个有机酸明显。有报道,提高H+浓度可抑制有机酸的解离,改变峰形。通过比较标准样在不同pH值下的分离色谱图以及酒样在不同pH下的谱图,最终选择pH2.3为最佳的pH。

2.1.3 其他分离条件的选择

美国安捷伦公司提供的Zorbax SB-C18(250×4.6 mm 5μm)色谱柱、Zorbax Extend-C18(250×4.6 mm5μm)色谱柱、Eclipse XDB-C18(250×4.6 mm 5μm)色谱柱都能用于有机酸的色谱分离。根据本研究条件,选择Zorbax SB-C18(250×4.6 mm 5μm)色谱柱,波长210 nm,流速1.0 mL/min,柱温30℃,进样量10.0 μL,冲洗方式为等度洗脱。

2.2 有机酸标准曲线的绘制

准确称取一定量的酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸及琥珀酸,用超纯水配成不同浓度的标准有机酸混合溶液。进样10μL,分别进行HPLC分析。通过线性回归处理峰面积y和有机酸含量x(g/100 mL)得回归方程(表1),相关系数除酒石酸为0.9983外,其余均在0.999以上,表明线性关系良好。

表1 各种有机酸的工作曲线及线性相关性

2.3 检测方法的评价

2.3.1 方法的回收率

将闽乐8年花雕黄酒酒样以体积比1∶1加入含有酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸的标准液,混合均匀,进样测定其含量,结果见表2。回收率/%=(样品加标后测得量-样品本底值)/标样加入量。结果表明,回收率在83.17%～117.3%,方法的准确度较高。由于黄酒酒样中酒石酸含量较低,而且在色谱图上出峰不明显,因此没有计算酒石酸的回收率。

表2 有机酸测定方法的回收率试验结果

2.3.2 方法的重现性

将闽乐红酒样重复进样测定4次,以考察方法的重现性。6种有机酸测定结果见表3,其中变异系数CV(%)=相对平均偏差(SD)/平均值(X),结果表明各种有机酸的变异系数在3.1%～5.8%,重现性较好。

表3 有机酸测定方法的重现性试验结果

2.4 酒样中有机酸的测定

对不同的酒样进行分析测定,由于各种酒的酿造工艺不同,所采用的原料也有差异,故其中的有机酸含量也有差异,具体结果见表4。从表4可以看出,黄酒中乳酸和乙酸的含量相对较高,葡萄酒中酒石酸和苹果酸的含量相对较高。图3是长城干白葡萄酒中有机酸的分离图谱。酒样的HPLC图谱中出现那么多的峰的原因可能是酒中的β-苯乙醇、生物胺、氨基酸等出峰。本研究由于实验条件限制,对于一些峰未能进行进一步的定性定量分析。

表4 九种酒样种有机酸的含量

图3 白葡萄酒的分离谱图

3 结论

采用高效液相色谱测定酒中的有机酸含量,确定了分离条件:色谱柱为XB-C18,5μm,150 mm×4.6 mm,紫外检测器,波长210 nm,流动相为0.02 mol/L KH2PO4-乙腈(98∶2),pH值2.3,流速1.0 mL/min,柱温30℃,进样量10.0μL,冲洗方式为等度洗脱。标定了7种有机酸的浓度-峰高标准曲线,其相关系数在0.9983～0.9999。

在优化的HPLC分析条件下,对市售的黄酒和葡萄酒中7种有机酸进行了定量、定性,分别是酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸。从测定的结果可以看出,黄酒中乳酸和乙酸在所测的7种有机酸中含量最高,葡萄酒中苹果酸和酒石酸在所测的7种有机酸中含量最高,此法的回收率在83.17%～117.3%,变异系数在3.1%～5.8%。考察的有机酸出峰时间都在6 min之内,能够快速地对黄酒、葡萄酒中的有机酸进行测定,满足企业对产品质量进行实时监控的要求。

[1]高海燕,王善广,胡小松.利用反相高效液相色谱法测定梨汁中有机酸的种类和含量[J].食品与发酵工业,2004,30(8):96-100.

[2]唐长波,岳田利.色谱法分析食品中的有机酸[J].食品科技,2006(10):249-251.

[3]魏晓敏.食品中的酸味物质[J].计量与测试技术,2007,34(8):56-57.

[4]谢文逸.酒类酸度及有机酸分析进展[J].酿酒科技,2002(2):81-82.

[5]李华.葡萄酒的总酸及pH值[J].酿酒,1987(6):9-12.

[6]冯向东.高效液相色谱法测定白酒中乳酸和乙酸含量[J].酿酒科技,2009(5):115-116.

[7]朱晓兰,高芸,苏庆德.毛细管气相色谱法测定番茄中的非挥发性有机酸、高级脂肪酸和低分子量糖类[J].食品科学,2004,25(9):152-157

[8]田鹏,徐烨,邓桂春,等.测定啤酒和葡萄酒中有机酸的离子排斥色谱法[J].分析测试学报,2002,21(4):68-70.

[9]Ito K,Takayama Y,Ikedom,et al.Determination of some aliphatic carboxylic acids in anaerobic digestion process waters by ion-exclusion chromatography with conductimetric detection on aweakly acidic cation-exchange resin column[J].J Chromatogr:A,2004,1039(1/2):141-145.

[10]Tanaka K,Morim,Xu Q,et al.I on-exclusion chromatography with conductimetric detection of aliphatic carboxylic acids on a weakly acidic cation-exchange resin by elution with benzoic acid-β-cyclodextrin[J].J Chromatogr:A,2003,997(1/2):127-132.

[11]庞新安,万英.反相高效液相色谱法测定果品中有机酸[J].中国食物与营养,2007(11):40-41.

[12]Silvia Suarez-Luque,Ines Mato,Jose F.Huidobro,Jesus S imal-Lozano.Rapid deter mination of minority organicacids in honey by high-perfor mance liquid chromatography[J].Jounral of ChromatographyA,2002,955:207-214.

[13]赵景蝉,郭治安,常建华,等.有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分离条件研究[J].色谱,2001,19(3):260-263.

[14]高年发,张军,韩英素.高效液相色谱法测定葡萄酒中的有机酸[J].酿酒,2004,31(1):67-69.

[15]张军,韩英素,高年发.HPLC法测定葡萄酒中有机酸的色谱条件研究[J].酿酒科技,2004,122(2):91-93.

[16]向阳,李崎,顾国贤.国内啤酒有机酸组成及其综合评价[J].食品科学,2007,28(1):266-269.

ABSTRACTThis paper established a method using RP-HPLC simultaneously and rapidly detecting of tartaric acid,for mic acid,malic acid,lactic acid,acetic acid,citric acid,succinic acid in rice wine and grape wine.The optimal separation conditions:the XB-C18(5μm,150mm×4.6mm)ultraviolet detector,wavelength 210 nm,mobile phase 0.02M KH2PO4-acetonitrile(98:2),pH 2.3,flow rate 1.0 ml/min,column temperature 30℃,injection of 10.0μl,Isocratic elution.The recovery rate ranged from 83.17 to 117.3%,and the relative standard deviations are 3.1%～5.8%.Reverse-phase high performance liquid chromatography can determine the organic acid in yellow rice wine and wine rapidly,which satisfy enterprises needs for real-t ime monitoring and quality control.

Key wordsreverse-phase,HPLC,s imultaneous determination,rice wine,wine organic acids

S imultaneousDeterm ination of Organic Acids in Wine with Reverse-phase High Performance L iquid Chromatography

Lv Xu-cong,Huang Zhi-qing,Huang Ruo-lan,Huang Bin-hong,Rao Ping-fan,NiLi
(Research Institute of Food Science and Technology,Fuzhou University,Fuzhou 350108,CHina)

博士(倪莉副教授为通讯作者,E-mail:nili@fzu.edu.cn)。

＊福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划资助项目(No.S W2006-16),福建省教育厅资助项目(No.JA 07022),福建省自然科学基金计划资助项目

2009-12-02,改回日期:2010-01-06